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英：differential display 英略語：DDRT-PCR, DD-PCR 仏：l'affichage différentiel | 英：differential display 英略語：DDRT-PCR, DD-PCR 仏：l'affichage différentiel | ||
ディファレンシャルディスプレイ（別名、"ディファレンシャルディスプレイRT-PCR (DDRT-PCR, DD-PCR)"）とは、[[wikipedia:ja:遺伝子|遺伝子]][[wikipedia:ja:発現|発現]]の量の差異を[[wikipedia:ja:ポリメラーゼ連鎖反応|PCR]]法により解析する方法の一種である。ここで、ディスプレイ(display)とは、目的遺伝子を[[wikipedia:ja:ゲル|ゲル]]上で視覚的に表示するとの意であり、多数のRNAにおいて、様々な発現パターンを示す[[wikipedia:ja:mRNA|mRNA]]を包括的に同定しその発現量を比較できることから、[[wikipedia:ja:ゲノム|ゲノム]]科学における遺伝子発現解析 に有力な手法である<ref name="Liang_Pardee_Science"><pubmed>1354393</pubmed></ref><ref name="Liang_Biotech"><pubmed>12188186</pubmed></ref><ref>'''野島博'''&amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;gt;最新生命科学キーワードブック&amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;gt;羊土社: 2007</ref>。 | ディファレンシャルディスプレイ（別名、"ディファレンシャルディスプレイRT-PCR (DDRT-PCR, DD-PCR)"）とは、[[wikipedia:ja:遺伝子|遺伝子]][[wikipedia:ja:発現|発現]]の量の差異を[[wikipedia:ja:ポリメラーゼ連鎖反応|PCR]]法により解析する方法の一種である。ここで、ディスプレイ(display)とは、目的遺伝子を[[wikipedia:ja:ゲル|ゲル]]上で視覚的に表示するとの意であり、多数のRNAにおいて、様々な発現パターンを示す[[wikipedia:ja:mRNA|mRNA]]を包括的に同定しその発現量を比較できることから、[[wikipedia:ja:ゲノム|ゲノム]]科学における遺伝子発現解析 に有力な手法である<ref name="Liang_Pardee_Science"><pubmed>1354393</pubmed></ref><ref name="Liang_Biotech"><pubmed>12188186</pubmed></ref><ref>'''野島博'''&amp;amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;amp;gt;最新生命科学キーワードブック&amp;amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;amp;gt;羊土社: 2007</ref>。 | ||
== 原理と適用例 == | == 原理と適用例 == | ||
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例えば、物質Aの添加により遺伝子Bの発現の増加/減少が見出された場合、この遺伝子Bの発現が物質Aにより誘導/抑制されていると考えられる。防御蛋白質や阻害作用の解析などに多くの適用が考えられる。脳神経科学領域では、ある[[学習]]課題が成立した動物個体としていない動物個体の細胞間で、発現に差のある遺伝子を同定することで、その学習に関与する遺伝子群が同定された適応例がある(図1および2)<ref><pubmed>10531455</pubmed></ref><ref><pubmed>11168596</pubmed></ref>。比較的感度が良く、実験操作も簡便に行うことができ、また必要に応じて、3試料以上の間での比較に拡張することも可能である。[[Image:DDRT-fig1.jpg|thumb|center|300px|図1 ディファレンシャルディスプレイ法の適応例。 軟体動物(ナメクジ)に連合学習試行を行い、条件付け群(paired group)と非条件付け群(unpaired group)の脳神経節間で、遺伝子発現の差異を検出した。paired groupまたはunpaired group特異的に発現が認められたバンド群を▶で示している。再右端のレーンはDNAサイズマーカーによる塩基対数を示す。各primer setに対して、4つのレーン(a, b, c, d)があり、aおよびbがpaired group、cおよびdがunpaired groupを示す(時期を変えて調整したtotal RNAを用いて2回行った)。使用したprimer setを下部に記載した。1, 4, 5, 7, 8, 9がpaired group特異的、2, 3, 6, 10がunpaired group特異で来なものとして同定された。]] | 例えば、物質Aの添加により遺伝子Bの発現の増加/減少が見出された場合、この遺伝子Bの発現が物質Aにより誘導/抑制されていると考えられる。防御蛋白質や阻害作用の解析などに多くの適用が考えられる。脳神経科学領域では、ある[[学習]]課題が成立した動物個体としていない動物個体の細胞間で、発現に差のある遺伝子を同定することで、その学習に関与する遺伝子群が同定された適応例がある(図1および2)<ref><pubmed>10531455</pubmed></ref><ref><pubmed>11168596</pubmed></ref>。比較的感度が良く、実験操作も簡便に行うことができ、また必要に応じて、3試料以上の間での比較に拡張することも可能である。[[Image:DDRT-fig1.jpg|thumb|center|300px|図1 ディファレンシャルディスプレイ法の適応例。 軟体動物(ナメクジ)に連合学習試行を行い、条件付け群(paired group)と非条件付け群(unpaired group)の脳神経節間で、遺伝子発現の差異を検出した。paired groupまたはunpaired group特異的に発現が認められたバンド群を▶で示している。再右端のレーンはDNAサイズマーカーによる塩基対数を示す。各primer setに対して、4つのレーン(a, b, c, d)があり、aおよびbがpaired group、cおよびdがunpaired groupを示す(時期を変えて調整したtotal RNAを用いて2回行った)。使用したprimer setを下部に記載した。1, 4, 5, 7, 8, 9がpaired group特異的、2, 3, 6, 10がunpaired group特異で来なものとして同定された。]] | ||
[[Image:DDRT-fig2.jpg|thumb|center|200px|図2 図1にて示したバンド群を拡大したもの。P: paired group、U: unpaired groupを示す。発現に差が認められたバンドを▶で示す。]]原法では、検出方法として[[wikipedia:ja:放射性同位元素|放射性同位元素]]（radioisotope, RI）を用いていた(RI-DD法)が<ref name="Liang_Pardee_Science" />、その後、蛍光標識された[[wikipedia:ja:プライマー (生物)|プライマー]]を用いて検出する「[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]ディファレンシャルディスプレイ (FDD) 法」が開発され、検出感度、操作性や再現性が高められた<ref name="Liang_Biotech" /><ref>'''伊藤隆司'''&amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;gt;Differential Display&amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;gt;実験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック改訂第4版（村松正實、 山本雅編）羊土社: 2003, pp. 60-64 （なお、第5版から本項目は削除されている）</ref>。 | [[Image:DDRT-fig2.jpg|thumb|center|200px|図2 図1にて示したバンド群を拡大したもの。P: paired group、U: unpaired groupを示す。発現に差が認められたバンドを▶で示す。]]原法では、検出方法として[[wikipedia:ja:放射性同位元素|放射性同位元素]]（radioisotope, RI）を用いていた(RI-DD法)が<ref name="Liang_Pardee_Science" />、その後、蛍光標識された[[wikipedia:ja:プライマー (生物)|プライマー]]を用いて検出する「[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]ディファレンシャルディスプレイ (FDD) 法」が開発され、検出感度、操作性や再現性が高められた<ref name="Liang_Biotech" /><ref>'''伊藤隆司'''&amp;amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;amp;gt;Differential Display&amp;amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;amp;gt;実験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック改訂第4版（村松正實、 山本雅編）羊土社: 2003, pp. 60-64 （なお、第5版から本項目は削除されている）</ref>。 | ||
== 利点と不利点 == | == 利点と不利点 == | ||
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本法は、単一ゲル上で多数の試料のバンド分布を同時に比較できることから効率良く遺伝子発現量の差が検出できるため、組織や細胞が発現する遺伝子とその発現量の解析、つまりtranscription imageの研究分野に急速に普及した。ただし、任意プライマーを用いてPCR反応を行うことから再現性が高いとは言えず、また、高感度であるが故にPCRの条件設定を厳密に行わないと擬陽性のバンドも出やすい。そのため、2000年代半ばには、高速かつ高感度で大量解析可能な[[DNAアレイ]]（DNAチップ）、RNA-seq、定量的[[wikipedia:ja:リアルタイムPCR|リアルタイムPCR]]（RT-PCR）などの技術の登場によってその相対的重要性は低下している<ref>英語版WikipediaのDifferential displayの項目。http://en.wikipedia.org/wiki/Differential_display</ref>。しかしながら、DNAアレイに比較して、ディファレンシャルディスプレイ法はコスト面、所要時間で未だ有利であり、出発材料が少量でも解析を行えるという利点も有する。また通常のDNAアレイと異なり、ディファレンシャルディスプレイ法では新規遺伝子の検出が可能であることなどの利点もあることから、今後も多くの分野で適用が期待される。 | 本法は、単一ゲル上で多数の試料のバンド分布を同時に比較できることから効率良く遺伝子発現量の差が検出できるため、組織や細胞が発現する遺伝子とその発現量の解析、つまりtranscription imageの研究分野に急速に普及した。ただし、任意プライマーを用いてPCR反応を行うことから再現性が高いとは言えず、また、高感度であるが故にPCRの条件設定を厳密に行わないと擬陽性のバンドも出やすい。そのため、2000年代半ばには、高速かつ高感度で大量解析可能な[[DNAアレイ]]（DNAチップ）、RNA-seq、定量的[[wikipedia:ja:リアルタイムPCR|リアルタイムPCR]]（RT-PCR）などの技術の登場によってその相対的重要性は低下している<ref>英語版WikipediaのDifferential displayの項目。http://en.wikipedia.org/wiki/Differential_display</ref>。しかしながら、DNAアレイに比較して、ディファレンシャルディスプレイ法はコスト面、所要時間で未だ有利であり、出発材料が少量でも解析を行えるという利点も有する。また通常のDNAアレイと異なり、ディファレンシャルディスプレイ法では新規遺伝子の検出が可能であることなどの利点もあることから、今後も多くの分野で適用が期待される。 | ||
なお、[[wikipedia:ja:蛋白質|蛋白質]]レベルにおける発現量を比較する「蛋白質ディファレンシャルディスプレイ法」という手法もある<ref>'''平野久''' &amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;gt;タンパク質のアミノ酸配列と翻訳後修飾の分析&amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;gt;蛋白質をみるー構造と挙動（長谷俊治、高尾敏文、高木淳一編）化学同人: 2009 pp. 1-32</ref>。これは、複数種の特定の細胞試料間で蛋白質の発現パターンの違いを分析する方法であり、一般的には二次元[[wikipedia:Gel electrophoresis|ゲル電気泳動]]で各細胞の蛋白質を分離し、そのパターンの差を比較する方法である。 | なお、[[wikipedia:ja:蛋白質|蛋白質]]レベルにおける発現量を比較する「蛋白質ディファレンシャルディスプレイ法」という手法もある<ref>'''平野久''' &amp;amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;amp;gt;タンパク質のアミノ酸配列と翻訳後修飾の分析&amp;amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;amp;gt;蛋白質をみるー構造と挙動（長谷俊治、高尾敏文、高木淳一編）化学同人: 2009 pp. 1-32</ref>。これは、複数種の特定の細胞試料間で蛋白質の発現パターンの違いを分析する方法であり、一般的には二次元[[wikipedia:Gel electrophoresis|ゲル電気泳動]]で各細胞の蛋白質を分離し、そのパターンの差を比較する方法である。 | ||
== 方法と手順 == | == 方法と手順 == | ||
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以下、通常のmRNA試料を対象としたディファレンシャルディスプレイ法について説明する (図3)。[[Image:Differentialdisplay2.jpg|thumb|250px|図2 ディファレンシャルディスプレイ法の手順]] | 以下、通常のmRNA試料を対象としたディファレンシャルディスプレイ法について説明する (図3)。[[Image:Differentialdisplay2.jpg|thumb|250px|図2 ディファレンシャルディスプレイ法の手順]] | ||
細胞中で発現したmRNAすべてを[[wikipedia:ja:逆転写|逆転写]]しcDNAを得た後、これを鋳型にして複数の混合プライマーを用いたPCRを行う。ここで、特異性を持たせずできるだけ多くの種類のcDNA断片を増幅するよう設定した複数のプライマーを用いることにより、非常に多数のバンドが得られる。１つの細胞で発現し得る約15, | 細胞中で発現したmRNAすべてを[[wikipedia:ja:逆転写|逆転写]]しcDNAを得た後、これを鋳型にして複数の混合プライマーを用いたPCRを行う。ここで、特異性を持たせずできるだけ多くの種類のcDNA断片を増幅するよう設定した複数のプライマーを用いることにより、非常に多数のバンドが得られる。１つの細胞で発現し得る約15,000種類の遺伝子すべての発現を網羅して探索するために、3種類のアンカープライマーと20種類の混成プライマー(10 mer)を用いてPCRを行う。得られたバンドの強弱を遺伝子発現の強度の指標とし、特定の物質添加の有無などさまざまな操作・環境の違いによりその細胞のどの遺伝子が変化しているかを見出す。 | ||
#アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） | #アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） | ||