「FM1-43」の版間の差分

'''==要約==''' <br>FM 色素は脂質二重膜を可逆的に染める蛍光色素で、シナプス前機能や分泌現象の計測に活用されている。

  4. 応用例　 ・シナプス前機能の解析　　

'''<br>==応用例=='''<br>'''シナプス前機能の解析シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出量の測定'''<br>細胞外を FM1-43 で還流中に、短い放出刺激を与え（例 20 Hz、30 発）、開口放出した小胞の膜を染める。 <br><br>[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|center|600px|図3]]<br>小胞は 30-60秒で細胞内部にエンドサイトーシスで取り込まれる。その後、細胞外を、色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素をwash out する。このような loading 過程を経て示される蛍光量は、30回の刺激時に開口放出した小胞にあたり Readily releasable pool （RRP）のサイズの指標となる。カエル NMJの場合、RRP の小胞数は神経終末内小胞の約 15％（12-17％）と報告された<ref><pubmed>　15044806 </pubmed></ref>。<br>

<br>次に、細胞外色素フリーの状態で放出刺激を与えると、前段階で染められた小胞は細胞膜と融合し、細胞外液への拡散により神経終末の蛍光は減弱する（destaining）。この減弱の程度や時間経過から、開口放出の量と速度が評価できる。蛍光減弱の時間経過は single exponential に近似されることから、Release probability（Pr） は蛍光減弱の時定数に反比例すると考えられる。Prの計算法として、（Recycling pool の小胞数×0.63）/ (37％に蛍光減弱するまでに与えた電気パルス数）で示す方法<ref><pubmed> 18701072 </pubmed></ref> が提起された。より簡易的には、FM1-43 の蛍光半減期の逆数<ref><pubmed> 11426227 </pubmed></ref>で示されるケースもある。<br>

<br>開口放出した顆粒は active zone の周辺から内部に取り込まれ（endocytosis）、再び放出可能となる（recycle）。このリサイクルにかかる時間は、海馬培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。そこで Recycling pool（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br>

<br>FM 色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。<br>FM2-10 や FM1-43 色素を用い、顆粒膜から離脱する完全融合型（full fusion）と、離脱しない不完全融合型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。  

'''<br>開口放出現象の可視化<br>'''FM1-43 を網膜双極性細胞のシナプス小胞に取り込ませて標識し、TIRF 顕微鏡で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。<br>また、下垂体前葉細胞 (lactotrophs) や膵島細胞においても、大型有芯小胞の膜融合に伴い、開口放出部位においてFM1-43 蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref>。