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{{box|text= パッチクランプ法は、[[イオンチャネル]]を介した[[wikipedia:ja:イオン|イオン]]の挙動（[[wikipedia:ja:電流|電流]]）を記録することで、細胞膜上の単一または複数のイオンチャネルの活動を直接的に測定する方法である。 | {{box|text= パッチクランプ法は、[[イオンチャネル]]を介した[[wikipedia:ja:イオン|イオン]]の挙動（[[wikipedia:ja:電流|電流]]）を記録することで、細胞膜上の単一または複数のイオンチャネルの活動を直接的に測定する方法である。[[培養細胞]]や急性単離標本、組織標本（スライス切片）、さらに行動下にある個体おいても適用可能であり、主に[[神経]]、[[wikipedia:ja:心筋|心筋]]、[[wikipedia:ja:平滑筋|平滑筋]]、[[感覚器]]細胞などを対象とした研究に用いられている。}} | ||
==パッチクランプ法とは== | |||
パッチクランプ法は[[電位固定法]]を基に、[[wikipedia:Erwin Neher|Erwin Neher]]と[[wikipedia:Bert Sakmann|Bert Sakmann]]によって開発された電気生理学的記録方法である<ref name=ref1><pubmed>1083489</pubmed></ref>。[[ガラス微小ピペット]]と細胞膜の間に非常に抵抗の高いシール（ギガシール）を形成させることにより、[[イオンチャネル]]を介した[[wikipedia:ja:イオン|イオン]]の挙動（[[wikipedia:ja:電流|電流]]）を記録することで、細胞膜上の単一または複数のイオンチャネルの活動を直接的に測定する方法である。彼らはこの方法により[[筋]]線維における単一[[アセチルコリン]]電流を直接的に検出し、イオン通過路としてのチャネルの存在を初めて証明した。その後、パッチクランプ法を応用した様々な方法の追加開発により、多くの細胞系に用いられるようになった。この技法を発明し、発展させたことにより、1991年にErwin NeherとBert Sakmannは[[wikipedia:ja:ノーベル生理学・医学賞|ノーベル生理学・医学賞]]を受賞した。 | |||
パッチクランプ法は[[電位固定法]]を基に、[[wikipedia:Erwin Neher|Erwin Neher]]と[[wikipedia:Bert Sakmann|Bert Sakmann]] | |||
== 基本的技術 == | == 基本的技術 == | ||
先端が開口している[[ガラス微小ピペット]]を電極として用いる。電極先端の径は1μmほどであり、この大きさは[[細胞膜]]上の[[イオンチャネル]] | 先端が開口している[[ガラス微小ピペット]]を電極として用いる。電極先端の径は1μmほどであり、この大きさは[[細胞膜]]上の[[イオンチャネル]]が数個入る程度である。さらに、熱加工により先端表面は滑らかであり、細胞膜と高抵抗で密着する。電極内部は、実験目的に応じて選択された電極内液によって満たされる。例えば、セルアタッチ法では、内液と細胞外液のイオン組成は同等とする。また、薬物を添加したり、イオン組成を変えたりして、異なる環境下のイオンチャネルの挙動を解析することも可能である。内液と接触している[[wj:塩化銀|塩化銀]]の金属線により、専用アンプへ電流を伝える。電極は細胞に接触し、吸引により内部に軽い陰圧をかけることで、細胞膜とピペット先端との隙間を非常に小さくする。この隙間の絶縁性は非常に高いため、電極内部と細胞外液の間の電気抵抗は非常に高くなる。この電気抵抗は1ギガオーム以上になるため、このピペットと細胞膜の密着をギガシールと呼ぶ。このギガシールにより、漏れ電流が非常に小さくなり、イオンチャネルの開閉による小さな電流を測定することが可能となる。 | ||
== 種々の方法 == | == 種々の方法 == | ||
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=== インサイド－アウト法 === | === インサイド－アウト法 === | ||
セルアタッチ法の状態からギガシールした電極を引き上げると、細胞からパッチ膜が切り離され、細胞膜の内側が細胞外液中に露出した状態がインサイドーアウト法である。これをインサイドーアウト法と呼ぶ。この方法ではイオンチャネルの細胞膜内側の条件を調節することが可能であり、細胞内リガンドによって影響されるイオンチャネルの解析に有用である。 | |||
=== ホールセル法=== | === ホールセル法=== | ||
下記の穿孔パッチ法と区別する時にはコンベンショナルホールセル法ともいう。セルアタッチ法から電極の陰圧をさらに強くすることでパッチ膜を破って穴を開け、電極内と細胞内が繋がる状態がホールセル法である。ホールセル法では、全細胞膜の複数のイオンチャネルを介した電流を記録することが可能である。ホールセル法は、電極を刺入して電流を記録する細胞内電極法と比較して、ギガシールの結果によりリーク電流が非常に少なく安定して記録することができる。しかし、穴を通して細胞内の可溶性成分が電極内液側へ漏出することにより細胞内から失われるという欠点がある。多くは細胞体から記録されるが、神経細胞の細胞体と樹状突起間ではチャネルの分布や特性が違うため、電流電位応答が異なる。樹状突起での微細な電流電位応答を記録するため、細胞体ではなく、樹状突起に電極を当てて記録するdendritic パッチクランプ法もある<ref><pubmed>17406407</pubmed></ref>。 | |||
=== アウトサイド－アウト法 === | === アウトサイド－アウト法 === | ||
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=== ルーズパッチ法 === | === ルーズパッチ法 === | ||
非侵襲的に細胞から記録を行うため、ギガシールよりも緩いシールを形成して記録を行う方法をルーズパッチ法と呼ぶ。シールが緩いので、記録後に電極を細胞膜から取り去っても細胞膜は無傷であり、細胞膜を壊すことなく、同じ細胞の異なる場所で繰り返し記録することが可能である。しかし、電極と細胞膜間の抵抗が低いため、電流が漏れやすいという欠点がある。この漏れ電流は、細胞の異なる場所での記録と比較することで補正することができる。 | 非侵襲的に細胞から記録を行うため、ギガシールよりも緩いシールを形成して記録を行う方法をルーズパッチ法と呼ぶ。シールが緩いので、記録後に電極を細胞膜から取り去っても細胞膜は無傷であり、細胞膜を壊すことなく、同じ細胞の異なる場所で繰り返し記録することが可能である。しかし、電極と細胞膜間の抵抗が低いため、電流が漏れやすいという欠点がある。この漏れ電流は、細胞の異なる場所での記録と比較することで補正することができる。 | ||
=== ブラインドパッチ法 === | === ブラインドパッチ法 === | ||
顕微鏡下で観察できない組織深部にある細胞から記録を行うために、[[wj:オシロスコープ|オシロスコープ]]上で電極抵抗の変化を観察しながら、細胞に電極を接触させ、記録を行う方法をブラインドパッチ法と呼ぶ。視覚的に標的細胞を選別しないため、無作為的に細胞から記録することができる。しかし、様々な種類の細胞が存在する場所では、どの種類の細胞から記録したのかわからないため、電極内液に標識物質等を添加し、記録後に細胞を同定する必要がある。 | |||
=== オートパッチクランプ法 === | === オートパッチクランプ法 === | ||
====ロボットによるブラインドパッチ法==== | |||
ブラインドパッチ法をロボットに応用させたin vivoでのパッチクランプ法が開発されている<ref><pubmed>22561988</pubmed></ref>。 | |||
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====プレート上でのパッチクランプ法==== | |||
複数のパッチ穴のあるプレートやチップ上の培養細胞でのパッチクランプ法が開発されている<ref><pubmed>12854998</pubmed></ref> <ref><pubmed>19149491</pubmed></ref>。短時間に大量のデータを取得することが可能であり、薬物のスクリーニングに有用である。 | |||
== 参考文献 == | == 参考文献 == | ||