「Förster共鳴エネルギー移動」の版間の差分

近年、データ処理速度の向上により、メガヘルツオーダーのパルス励起光によって励起された一つ一つの光子を、迅速に検出する時間相関単一光子計数法が発展してきた。励起光によって発生した一つ一つの光子の発生時間の確率分布が減衰曲線を形成するため、蛍光寿命を得ることができる。蛍光寿命は、蛍光の減衰曲線の速度定数<math>k \ </math>と逆数の関係にある。 蛍光寿命は、GFPは2.5nsec、その色彩変異体,黄色蛍光タンパク質YFPでは2.9nsec、mCherryでは1.5nsecの値を取る。FRETが起きるとドナーの蛍光寿命が減少する(図4)。Double exponetial fittingによって、FRETの起きている割合が算出できる。蛍光寿命は、蛍光強度比測定法に比べて、蛍光の漏れ込み、アクセプターとの局在の違いなどによって生じる疑似FRETを回避できる。FRETデータ取得において、より理想的であると考えられる。

 

この原理は、FRETプローブの最も初期に導入されたデザインである。例として、Factor Xなどのプロテアーゼによって分解される配列の両端にドナーとアクセプターを連結する。プロテアーゼによって、この配列が分解されるとドナーとアクセプターの間に起きていたFRETが解消されることによって、プロテアーゼの活性を評価する。カスパーゼなどの活性を測定するためにも使用されている。このプローブのデザインの短所としては、反応が不可逆的であるために、一つの実験系で何度も測定することが困難であることである。

興味のあるタンパク質が、活性化の際に構造変化を誘起することが知られている場合には構造変化を利用することができる。タンパク質のC末およびN末にドナーおよびアクセプターを連結する。この手法は、CaMKII、Calcinulin, raf, 膜電位測定などに用いられている。

===３－２．タンパク質結合に伴う構造変化を基にしたFRETプローブ===

ある種のタンパク質は活性化、非活性化に伴い、下流のタンパク質と結合する。このような相互作用を利用してタンパク質の活性化、非活性化を測定することができる。低分子G-proteinの活性化を測定するためにも用いられている。カルシウムFRETプローブ、カメレオンはこの原理を利用している。また、G-proteinの活性化プローブは、ドナー、アクセプター、G-protein、シグナル伝達下流の結合タンパク質の結合ドメインからなる。G-proteinがGDPからGTP結合型になり活性化すると、結合ドメインと相互作用をしFRETが生じる。

===３－３.　共有結合修飾によって生じる構造変化を測定するプローブ===

===３－４．生体膜上の小分子を測定するFRETプローブ===