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→‎FRETの画像検出
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==FRETの画像検出==
==FRETの画像検出==
　FRETによって蛍光寿命の減少、ドナーの蛍光強度の減少、アクセプターの蛍光の増加などが観察される。液体サンプルであれば蛍光分光光度計を用いる事で検出する事が可能であるが、画像として取得する場合には観察したい対象の特性を考慮しつつ、方法を選択していく。
　FRETによって蛍光寿命の減少、ドナーの蛍光強度の減少、アクセプターの蛍光の増加などが観察される。液体サンプルであれば蛍光分光光度計を用いる事で検出する事が可能であるが、画像として取得する場合には観察したい対象の特性を考慮しつつ、方法を選択していく。
===蛍光強度比イメージング===
===蛍光強度比イメージング===
　ドナーおよびアクセプターの蛍光を取得後、ドナーとアクセプターの蛍光強度比が計算される。FRETが起きると、ドナーの蛍光強度が減少し、アクセプターの蛍光強度が増加する。現在、最も広く使用されている手法である。タイムラプス解析も行える。現在、多数の遺伝子工学的に作製されたタンパク質FRETプローブにおいて、GFPの色彩変異体、シアン色蛍光タンパク質CFPと黄色蛍光タンパク質YFPのFRETペアが広範に用いられている。近年、CloverとmRuby2が開発され、より良いFRETペアであると報告されている<ref><pubmed>22961245</pubmed></ref>。
　ドナーおよびアクセプターの蛍光を取得後、ドナーとアクセプターの蛍光強度比を計算する。FRETが起きると、ドナーの蛍光強度が減少し、アクセプターの蛍光強度が増加する。現在、最も広く使用されている手法である。タイムラプス解析も行える。


　ドナー蛍光強度は、FRET効率Eと次のような関係に有る。
　ドナー蛍光強度は、FRET効率Eと次のような関係に有る。
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　ここで&tau;'<sub>D</sub>と&tau;<sub>D</sub>はそれぞれ、アクセプターが存在する場合と存在しない場合でのドナー蛍光寿命である。つまり、FRETが起きると、蛍光寿命が減少する(図4)。
　ここで&tau;'<sub>D</sub>と&tau;<sub>D</sub>はそれぞれ、アクセプターが存在する場合と存在しない場合でのドナー蛍光寿命である。つまり、FRETが起きると、蛍光寿命が減少する(図4)。


　蛍光寿命は、[[GFP]]は2.5nsec、YFPでは2.9nsec、mCherryでは1.5nsec程度の値を取る。蛍光寿命プローブとしてはドナーとしてmGFP、アクセプターとしてmRFPもしくはmCherryが用いられる。アクセプターの蛍光は必要ないため、FRETのアクセプターとなるが蛍光を発しないREACh, darkVenus, superREAChなども用いられる。同じ理由により、蛍光寿命は、蛍光強度比測定法に比べて、蛍光の漏れ込み、アクセプターとの局在の違いなどによって生じる疑似陽性を回避できる。
　蛍光寿命は、[[GFP]]は2.5nsec、YFPでは2.9nsec、mCherryでは1.5nsec程度の値を取る。蛍光寿命プローブとしてはドナーとしてmGFP、アクセプターとしてmRFPもしくはmCherryが用いられる。アクセプターの蛍光は必要ないため、蛍光寿命測定法は、蛍光強度比測定法に比べて、蛍光の漏れ込み、アクセプターとの局在の違いなどによって生じる疑似陽性を回避できる。


　蛍光寿命の変化を測定する方法は２つある。
　蛍光寿命の変化を測定する方法は２つある。
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