「超解像蛍光顕微鏡」の版間の差分

[[Image:PALM図8.png|400px|thumb|'''図１　PALMの原理'''<br>①視野内の疎らなPSFPのオン。オン状態のPSFPの位置をグレーの◯で示した。<br>

②蛍光一分子画像の取得。主に全反射顕微鏡によって行うが共焦点顕微鏡の利用も可能である。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従った広がりを持っている。撮影後は視野内のオン状態のPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。<br>

③座標推定による分子の局在画像の構築。これは②の蛍光一分子画像をガウス関数でフィッティングして、蛍光分子の「座標」を推定する事である<ref group="注">フィッティング式、必要なら最後でOK</ref>。さらに、推定座標の「不確かさ」も求められる。座標推定から構築した点は②の相当する点に比べて小さくなるが、この点の輝度も2次元のガウス関数として表現される。ガウス関数の中心が上記のフィッティングにより推定された「座標」、標準偏差が「不確かさ」に相当する<ref group="注">2次元ガウス関数、必要なら最後に</ref>。また、一分子当たりの輝度の合計が等しくなるように規格化される。つまり、精度が高く推定された点は小さく明るい点、精度が低く推定された点は大きく広がった暗い点として局在画像では表現される事になる。<br>

④上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事で、PALM画像を得る事ができる。<br>

====PALM====

光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり、2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では200-300 nm程度である。しかしながら、隣り合った2点が重ならないほど離れていれば、蛍光一分子のPSFを2次元のガウス関数でフィッティングする事で、条件によっては~1.5 nmの精度で位置を決定できる。この蛍光一分子の正確な位置解析は（FIONA；fluorescence imaging with one-nanometer accuracy）として知られる<ref><pubmed> 12791999 </pubmed></ref>。超解像顕微鏡法の一つであるLocalization microscopy（蛍光一分子局在化顕微鏡法）は、FIONAを利用し光学顕微鏡の分解能を超えた画像を取得する方法である。このアイディアは古くからあったが、実現はされなかった。例えばGFPを発現した細胞にFIONAをそのまま適用する事は以下の点で困難なためである。<br>

====その他の蛍光一分子局在化法====

蛍光一分子局在化法はPALMの他にも様々な方法が開発されているが、異なるのは図-①においてどのように蛍光一分子を疎らにオンするかだけであり、FIONAに相当する図-②,③の操作はほぼ同じと考えて良い。そこで、PALM以外の主な蛍光一分子局在化法に関しては以下に簡潔に記載する。<br>

FPALM（Fluorescence photoactivation localization microscopy）<ref><pubmed> 16980368 </pubmed></ref>、STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）<ref><pubmed> 16896339 </pubmed></ref>はPALMとほぼ同時期に発表された。FPALMではPALMと同じくPSFPを利用している。STORMでは蛍光色素がある条件下で暗状態と蛍光状態を可逆的に遷移する現象を利用している。具体的には、シアニン系色素(例えばCy5)に強い励起光(赤色)を与えた際に、寿命の非常に長い暗状態に入る<ref group="注">三重項を経た暗状態で寿命が1時間程度とされる。三重項のクエンチャーとして働く酸素分子は暗状態への遷移を阻害する。また、この暗状態はチオールとの結合により起こる。</ref><ref><pubmed> 15783528 </pubmed></ref><ref><pubmed> 19961226 </pubmed></ref>。この暗状態において、より蛍光波長の短い別のシアニン系色素(例えばCy3)が近接している際にその励起光(緑色)を当てる事で蛍光状態への回復が起こるため、これを疎らな蛍光一分子のオンへと応用できる<ref><pubmed> 15783528 </pubmed></ref>。STORMではそのため2色の蛍光色素、2波長の光源を必要とするが、その後に報告されたdSTORM (direct STORM)<ref><pubmed> 18646237 </pubmed></ref>やGSDIM(ground-state depletion  

and single-molecule return)<ref><pubmed> 18794861 </pubmed></ref>では、暗状態からの回復が別の蛍光色素の近接やその励起光無しでも非常に稀に起こる事を利用し、2つ以上の異なる蛍光色素をオン、オフさせる事が容易となりマルチカラー化への道を開いた。<br>

蛍光一分子局在化法のための蛍光色素の開発は現在も活発にされており、最近になり、自然に明滅を繰り返す蛍光色素HMSiR（Hydroxymethyl Si-rhodamine）が開発された<ref><pubmed> 25054937 </pubmed></ref>。これは高濃度のチオールや暗状態を作るための強い励起光照射が不要なため、サンプルへのダメージを最小限に抑えられるといったメリットが有る。