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「超解像蛍光顕微鏡」の版間の差分
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[[Image:PALM図8.png|400px|thumb|'''図１ PALMの原理'''<br>'''①光刺激による疎らなPSFPのオン''' 実際には画像は撮影されないが蛍光状態がオフからオンに切り替わったPSFPの視野内での位置を灰色の点で示した。<br> | [[Image:PALM図8.png|400px|thumb|'''図１ PALMの原理'''<br>'''①光刺激による疎らなPSFPのオン''' 実際には画像は撮影されないが蛍光状態がオフからオンに切り替わったPSFPの視野内での位置を灰色の点で示した。<br> | ||
'''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得''' 蛍光観察は主に全反射顕微鏡によって行う。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従った広がりを持つ。撮影後は視野内にあるオンのPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。<br> | '''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得''' 蛍光観察は主に全反射顕微鏡によって行う。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従った広がりを持つ。撮影後は視野内にあるオンのPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。<br> | ||
'''③座標推定による分子の局在画像の構築''' ②の蛍光一分子画像を2次元のガウス関数で解析する事で、視野内での蛍光分子の「座標」を推定する。同時に推定座標の「不確かさ」も求まる<ref group="注"> | '''③座標推定による分子の局在画像の構築''' ②の蛍光一分子画像を2次元のガウス関数で解析する事で、視野内での蛍光分子の「座標」を推定する。同時に推定座標の「不確かさ」も求まる<ref group="注">解析は輝点を以下の2次元のガウス関数にフィッティングする事で行う。<br> | ||
''PSF''(''x'',''y'',''A'',''w<sub>m</sub>'') = ''A'' exp{-[(''x''-''x<sub>m</sub>'')<sup>2</sup> + (''y''-''y<sub>m</sub>'')<sup>2</sup>]/2''w<sub>m</sub>''<sup>2</sup>}<br> | ''PSF''(''x'',''y'',''A'',''w<sub>m</sub>'') = ''A'' exp{-[(''x''-''x<sub>m</sub>'')<sup>2</sup> + (''y''-''y<sub>m</sub>'')<sup>2</sup>]/2''w<sub>m</sub>''<sup>2</sup>}<br> | ||
解析で得られる(''x<sub>m</sub>'',''y<sub>m</sub>'')が推定された分子の座標、''w<sub>m</sub>''は輝点の広がり具合に相当し、以下の式から推定した座標の「不確かさ(σ<sub>''x,y''</sub>)''<sub>m</sub>''」を計算する際に用いられる。他のパラメータとして蛍光一分子の発した総フォトン数(''N<sub>m</sub>'')・画像の1ピクセルのサイズ(''a'')・バックグラウンドの総フォトン数(''b<sub>m</sub>'')を用いる。<br> | |||
解析で得られる(''x<sub>m</sub>'',''y<sub>m</sub>'')が推定された分子の座標、''w<sub>m</sub>''は輝点の広がり具合に相当し、以下の式から推定した座標の「不確かさ(σ<sub>''x,y''</sub>)''<sub>m</sub>'' | (σ<sub>''x,y''</sub><sup>2</sup>)''<sub>m</sub>'' = (''w<sub>m</sub>''<sup>2</sup> + ''a''<sup>2</sup>/12)/''N<sub>m</sub>'' + 4π<sup>1/2</sup>''w<sub>m</sub>''<sup>3</sup>''b<sub>m</sub>''<sup>2</sup>/''aN<sub>m</sub>''<sup>2</sup> </ref>。座標推定から構築した点は②の元の点に比べて小さくなるが、極小の一点として表されるわけではなく、この点もまた2次元のガウス関数の輝度分布として表わされる。解析により求められた「座標」と「不確かさ」がそれぞれこの2次元のガウス関数の中心と標準偏差になる。また各一分子の輝度の合計が等しくなるように規格化される。この結果、精度が高く推定された点は小さな明るい点として、精度が低く推定された点は大きな暗い点として局在画像上で表わされる。<br> | ||
(σ<sub>''x,y''</sub><sup>2</sup>)''<sub>m</sub>'' = (''w<sub>m</sub>''<sup>2</sup> + ''a''<sup>2</sup>/12)/''N<sub>m</sub>'' + 4π<sup>1/2</sup>''w<sub>m</sub>''<sup>3</sup>''b<sub>m</sub>''<sup>2</sup>/''aN<sub>m</sub>''<sup>2</sup> | |||
</ref> | |||
'''④1-Nサイクルの積分によるPALM画像の構築''' 上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで（Nサイクル）繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事でPALM画像が得られる<ref group="注">実際は全ての点をPALM画像に入れるのではなく、推定座標の「不確かさ」が大きな点はPALM画像には含めないという"足切り"操作が行われる。</ref>。最終的に得られるPALM画像の輝度は「蛍光分子がその位置で見つかる可能性」に比例するので、PALM画像は分子の出現確率密度地図に相当する。]] | '''④1-Nサイクルの積分によるPALM画像の構築''' 上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで（Nサイクル）繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事でPALM画像が得られる<ref group="注">実際は全ての点をPALM画像に入れるのではなく、推定座標の「不確かさ」が大きな点はPALM画像には含めないという"足切り"操作が行われる。</ref>。最終的に得られるPALM画像の輝度は「蛍光分子がその位置で見つかる可能性」に比例するので、PALM画像は分子の出現確率密度地図に相当する。]] | ||