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「超解像蛍光顕微鏡」の版間の差分
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===Localization Microscopy=== | ===Localization Microscopy=== | ||
[[Image:PALM図8.png|400px|thumb|'''図１ PALMの原理'''<br>'''①光刺激による疎らなPSFPのオン''' 実際には画像は撮影されないが蛍光状態がオフからオンに切り替わったPSFPの視野内での位置を灰色の点で示した。<br> | [[Image:PALM図8.png|400px|thumb|'''図１ PALMの原理'''<br>'''①光刺激による疎らなPSFPのオン''' 実際には画像は撮影されないが蛍光状態がオフからオンに切り替わったPSFPの視野内での位置を灰色の点で示した。<br> | ||
'''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得''' | '''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得''' 蛍光観察は主に全反射顕微鏡によって行う。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従い分布する。撮影後は視野内にあるオンのPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。<br> | ||
'''③座標推定による分子の局在画像の構築''' | '''③座標推定による分子の局在画像の構築''' ②の蛍光一分子画像の各輝点を2次元のガウス関数で解析する事で、視野内での各蛍光分子の「座標」を推定する。同時に推定座標の「不確かさ」も求まる<ref group="注">解析は輝点(先述の通り、2次元のPSFに従った分布を持つ)を以下の2次元のガウス関数にフィッティングする事で行う。<br> | ||
''PSF''(''x'',''y'',''A'',''w<sub>m</sub>'') = ''A'' exp{-[(''x''-''x<sub>m</sub>'')<sup>2</sup> + (''y''-''y<sub>m</sub>'')<sup>2</sup>]/2''w<sub>m</sub>''<sup>2</sup>}<br> | ''PSF''(''x'',''y'',''A'',''w<sub>m</sub>'') = ''A'' exp{-[(''x''-''x<sub>m</sub>'')<sup>2</sup> + (''y''-''y<sub>m</sub>'')<sup>2</sup>]/2''w<sub>m</sub>''<sup>2</sup>}<br> | ||
解析で得られる(''x<sub>m</sub>'',''y<sub>m</sub>'')が推定された分子の座標、''w<sub>m</sub>''は輝点の広がり具合に相当し、以下の式から推定した座標の「不確かさ(σ<sub>''x,y''</sub>)''<sub>m</sub>''」を計算する際に用いられる。他のパラメータとして蛍光一分子の発した総フォトン数(''N<sub>m</sub>'')・画像の1ピクセルのサイズ(''a'')・バックグラウンドの総フォトン数(''b<sub>m</sub>'')を用いる。<br> | 解析で得られる(''x<sub>m</sub>'',''y<sub>m</sub>'')が推定された分子の座標、''w<sub>m</sub>''は輝点の広がり具合に相当し、以下の式から推定した座標の「不確かさ(σ<sub>''x,y''</sub>)''<sub>m</sub>''」を計算する際に用いられる。他のパラメータとして蛍光一分子の発した総フォトン数(''N<sub>m</sub>'')・画像の1ピクセルのサイズ(''a'')・バックグラウンドの総フォトン数(''b<sub>m</sub>'')を用いる。<br> | ||
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'''④1-Nサイクルの積分によるPALM画像の構築''' 上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで（Nサイクル）繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事でPALM画像が得られる<ref group="注">実際は全ての点をPALM画像に入れるのではなく、推定された座標の「不確かさ」やフィッティング誤差による"足切り"操作が行われる。</ref>。最終的に得られるPALM画像の輝度は「蛍光分子がその位置で見つかる可能性」に比例するので、PALM画像は分子の出現確率密度地図に相当する。]] | '''④1-Nサイクルの積分によるPALM画像の構築''' 上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで（Nサイクル）繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事でPALM画像が得られる<ref group="注">実際は全ての点をPALM画像に入れるのではなく、推定された座標の「不確かさ」やフィッティング誤差による"足切り"操作が行われる。</ref>。最終的に得られるPALM画像の輝度は「蛍光分子がその位置で見つかる可能性」に比例するので、PALM画像は分子の出現確率密度地図に相当する。]] | ||
光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では250 | 光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では250 nm程度である。しかしながら、輝点が重ならないほど十分に離れていれば、それを2次元のガウス関数で解析する事で最大1 nm程度の精度でその位置を推定できる。このような蛍光一分子の正確な位置解析は現在FIONA(Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy）という名前で知られている<ref><pubmed> 12791999 </pubmed></ref>。超解像顕微鏡法の分類の一つであるLocalization microscopy（蛍光一分子局在化顕微鏡法）は、FIONAを利用し光学顕微鏡の分解能を超えた画像を取得する方法である。このようなアイディアは古くから提案されていたが<ref><pubmed> 19859146 </pubmed></ref>、理想的なサンプルを作成するのが困難なため実現はされなかった。例えばGFPを興味のあるタンパク質と融合させ、それを発現した細胞を想定する。この細胞にFIONAを適用しようとすると、ほぼ確実に以下の問題が生じる。<br> | ||
# 発現しているGFPの数が多いため、隣り合ったGFPのPSFが重なりあってしまいFIONAを適用できない。 | # 発現しているGFPの数が多いため、隣り合ったGFPのPSFが重なりあってしまいFIONAを適用できない。 | ||
# 上記の状況を回避するためにPSFの重なりが無い程度に一つの細胞にGFPを極少なく発現させる事は困難である。 | # 上記の状況を回避するためにPSFの重なりが無い程度に一つの細胞にGFPを極少なく発現させる事は困難である。 | ||