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「共焦点レーザー走査型顕微鏡」の版間の差分
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[[image:共焦点レーザー顕微鏡3.png|thumb|300px|'''図3．XYに走査（スキャン）する方法の概念図''']] | [[image:共焦点レーザー顕微鏡3.png|thumb|300px|'''図3．XYに走査（スキャン）する方法の概念図''']] | ||
共焦点レーザー顕微鏡は、点状に集光したレーザー励起光（レーザースポット）をサンプル上を移動（これを走査[scan] | 共焦点レーザー顕微鏡は、点状に集光したレーザー励起光（レーザースポット）をサンプル上を移動（これを走査[scan]という）させながらサンプルの蛍光を検出することによって像をつくる。光源にレーザーが採用されている理由は、レーザーが点光源に近いのでサンプルに点状に投影できるという理由による。また、一般に複数の波長の異なるレーザーが搭載され、音響光学素子によって波長ごとに高速にレーザーのOn/Offができる。 | ||
＊線状の光を走査する方式の共焦点顕微鏡もある。 | ＊線状の光を走査する方式の共焦点顕微鏡もある。 | ||
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:'''スキャンによるズーム機能'''：ガルバノミラーの振り幅を小さくすることによって、サンプルの特定の箇所を集中的に走査し、その部分を拡大して見せる機能。 | :'''スキャンによるズーム機能'''：ガルバノミラーの振り幅を小さくすることによって、サンプルの特定の箇所を集中的に走査し、その部分を拡大して見せる機能。 | ||
:'''スキャンによる画像回転機能''' | :'''スキャンによる画像回転機能'''：スキャンする方向をＸ方向またはＹ方向だけではなく、斜め方向にスキャンすることによってあたかもサンプルが回転したかのように見える機能。画像内でサンプルの向きを調節することができる。 | ||
:'''光刺激機能'''：特定の部分のみに光を照射する機能。細胞の一部に光を照射しその後の時間的経過を調べるたり、サンプルの一部分の蛍光を褪色させてその後周囲からの蛍光物質の流入を調べたりすることができる。 | :'''光刺激機能'''：特定の部分のみに光を照射する機能。細胞の一部に光を照射しその後の時間的経過を調べるたり、サンプルの一部分の蛍光を褪色させてその後周囲からの蛍光物質の流入を調べたりすることができる。 | ||
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:'''シーケンシャルスキャン機能'''：2つの波長のレーザーと2つの検出器を電気的に高速で切り替えることができ、2色の蛍光色素を用いている場合に互いの蛍光波長の重複（クロストーク）を最小化することができる。例えばGFPとDsRedの2種類の蛍光タンパクを使っている場合、青色レーザーでGFPを励起し、緑色の蛍光波長のみを第1の検出器で検出し、緑色レーザーでDsRedを励起し赤色の波長のみを第2の検出器で検出するという具合に行なう。（落射蛍光顕微鏡とカメラの組み合わせの場合、機械的にフィルターを交換する時間がかかり、共焦点レーザー顕微鏡ほど早く制御できない。） | :'''シーケンシャルスキャン機能'''：2つの波長のレーザーと2つの検出器を電気的に高速で切り替えることができ、2色の蛍光色素を用いている場合に互いの蛍光波長の重複（クロストーク）を最小化することができる。例えばGFPとDsRedの2種類の蛍光タンパクを使っている場合、青色レーザーでGFPを励起し、緑色の蛍光波長のみを第1の検出器で検出し、緑色レーザーでDsRedを励起し赤色の波長のみを第2の検出器で検出するという具合に行なう。（落射蛍光顕微鏡とカメラの組み合わせの場合、機械的にフィルターを交換する時間がかかり、共焦点レーザー顕微鏡ほど早く制御できない。） | ||
一点のみの走査なので、像をつくるのに時間がかかるという欠点がある。したがって時間的な変化があるサンプルの場合、像の上部と下部では取得時刻に時間差があり、同じ画面内で同じ現象が映っていても全体が同時に起きているとは言えない。速く撮ろうとすると画素を少なくするなど工夫しなければならない。（最近、共振ガルバノミラーという高速で振動するミラーがあり、1秒に30枚程度の画像を取得することができるようになった。） | |||
また、十分な蛍光シグナルが得られない場合、光電子増倍管による信号の増幅率を高くすると、光電子増倍管の中で発生する熱電子によるノイズが顕著に現れ、画像がザラついた感じになる。このような場合、走査する速度を遅くして信号強度を増やす、複数枚の画像の平均処理を行うなどして、画像の改善を行う。（最近はガリウム砒素リン光電子増倍管など、より高感度な検出器も登場している。） | また、十分な蛍光シグナルが得られない場合、光電子増倍管による信号の増幅率を高くすると、光電子増倍管の中で発生する熱電子によるノイズが顕著に現れ、画像がザラついた感じになる。このような場合、走査する速度を遅くして信号強度を増やす、複数枚の画像の平均処理を行うなどして、画像の改善を行う。（最近はガリウム砒素リン光電子増倍管など、より高感度な検出器も登場している。） | ||