「ゲノム編集」の版間の差分

== CRISPR/Casシステム ==

==== CRISPR/Cas9システム ====

==== CRISPR/Cpf1システム ====

==== CRISPR/dCAS9-BEシステム ====

==== CRISPR/Cas13(C2c2)システム ====

==== CRISPR/dCas13-ADARシステム ====

== CRISPR/Casシステムの神経科学への応用 ==

=== 細胞への応用[19] ===

　[[ヒストン]]の修飾やDNAの[[メチル化]]などの[[エピゲノミックな修飾]]は、[[脳形成]]や[[神経可塑性]]において重要な役割をもち、さらに、[[精神神経疾患]]の発症に関与することが報告されている。CRISPR/Casシステムを用いることにより、従来困難であった特定のゲノム領域のエピゲノミックな修飾状態を改変する「エピゲノム編集」が可能になった<ref><pubmed>28985525</pubmed></ref>[24]。

　[[wj:ルドルフ・イエーニッシュ|Rudolf Jaenisch]]のグループは、dCas9にTet1（シトシンのメチル基を除去する酵素）を融合させた人工タンパク質を用い、[[wj:脆弱X症候群|脆弱X症候群]]のiPS細胞モデルの治療に成功している<ref><pubmed>29456084</pubmed></ref>[26]。Fragile X症候群では、FMR1遺伝子の転写開始より少し上流にあるCGGの繰り返し配列が増加しメチル化が促進され、FMR1遺伝子の発現が抑制されている。脆弱X症候群の患者さんから作成したiPS細胞に、FMR1遺伝子の転写開始より少し上流を標的にしたガイドRNAとdCas9-tet1を導入し、CGGの繰り返し配列のメチル基を外し、FMR1遺伝子の発現を回復させることに成功した。FMR1遺伝子の発現が回復した患者iPS細胞を神経細胞に分化させると、神経細胞の過活動が正常に戻った。

　さらに最近、従来の「顕微注入法」で必要とされる受精卵の単離、顕微注入、移植といった一連の作業を省略できる[[GONAD]]([[Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery]])法が報告された<ref><pubmed>29482575</pubmed></ref>[27]。GONAD法では、0.7日胚（着床前）を有する妊娠雌マウスの[[wj:卵管|卵管]]に標的配列に対するガイドRNA、Cas9をコードするmRNAを注入し、卵管全体に対し直接[[電気穿孔法]]を行う。CRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子改変動物の作製法は、そのきわめて迅速で簡便で高い効率性が特徴である。以下に、遺伝子欠損・塩基置換・外来遺伝子ノックイン動物の作成法を、マウスを中心に概説する。

　従来、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集では、Cas9およびガイドRNAをともにRNAの形で受精卵の前核に顕微注入している（'''図5'''）。従来法でCas9がヌクレアーゼとして前核内で働くためには、まず注入されたCas9 mRNAが前核から細胞質へ輸送され、蛋白質に翻訳され、さらに翻訳された蛋白質が再度、前核に移行し、標的部位に到達、切断を行う必要がある。この過程は時間を要する。外来遺伝子のノックインに必要な相同組換えは、細胞周期のS期からG2期にのみ起こることから、その効率を上げるためには、Cas９は受精卵に注入後できるだけ早くDNA二本鎖切断活性を持つ必要がある。

　このクローニングフリーCRISPR/Cas9システムは、ガイドRNAの活性評価も簡便である。従来のような培養細胞を用いた実験は必要なく、試験管内で標的配列を含む[[PCR]]産物、Cas9蛋白質、crRNA、tracrRNAをインキュベートして電気泳動するだけで（''in vitro'' digestion assay：IDA）、その切断活性を調べることができる。クローニングフリーCRISPR/Cas9システムを用い、Act (βactin)遺伝子座に[[EGFP]]（enhanced green fluorescent protein）を含む2.5 kbの外来遺伝子をノックインするマウスを作成したところ、およそ50%の新生仔マウスにEGFPが目的部位にノックインされていた。従来用いられてきたCas9 mRNAとsgRNAからなる2要素システムを用い対照実験を行ったところ、その効率は10%程度だった。このことからクローニングフリーCRISPR/Cas9システムは、外来遺伝子のノックイン効率を大幅に向上させることが明らかになった<ref name=Aida2015/>[30]。さらに作製したノックインマウスを野生型マウスと交配し、次世代への伝達効率を調べたところ、すべての系統から、50%の効率で次世代のノックインマウスが得られた。このことは、従来型CRISPR/Cas9システムで問題となるモザイク（同一個体内の一部の細胞のみに遺伝子改変が起こっている）の頻度が低いことを示している。つまり、クローニングフリーCRISPR/Cas9システムでは、標的部位のDNA二本鎖切断が迅速に起こり、受精卵の第一卵割までに片アリルに外来遺伝子がノックインされたことを示している。またオフターゲット変異の候補となる部位を解析したところ、いずれのノックインマウスでも変異は検出されなかった。このことは、クローニングフリーCRISPR/Cas9システムでは、Cas9を蛋白質として注入したことによりCas9の半減期が短くなり、標的部位を切断した後迅速に分解されるため、従来型CRISPR/Cas9システムの大きな課題であるオフターゲット変異（ガイドRNA配列に類似した配列の非特異的切断）が大幅に減少することを示している。

　　クローニングフリーCRISPR/Cas9システムを用いた外来遺伝子ノックインマウス作成法の欠点は、煩雑なターゲッティングベクターの作成が必要な点である。その点を改良したのが、[[PITCh]]([[Precise Integration into Target Chromosomes]])法である（'''図6'''）<ref><pubmed> 25410609</pubmed></ref>[32]。PITCh法は、相同組換やNHEJと異なるDNA二本鎖切断の修復機構である[[マイクロホモロジー媒介末端結合]]([[microhomology mediated end-joining]]; [[MMEJ]])を利用した外来遺伝子のノックイン法である。MMEJは、DNA二本鎖切断の際に生じた切断末端間で、相補的配列（5〜25塩基対）同士で結合し、DNA二本鎖切断を修復する機構である。従来の相同組換えを利用した遺伝子挿入法では、挿入効率を上げるため外来遺伝子の両側に500〜1000塩基対の相同配列を付加したターゲッティングベクターを作成する必要があった。しかし、PITCh法では相同配列の長さが約20塩基対でよく、ターゲッティングベクターの作成が簡便化される。PITCh法では、ターゲッティングベクターにCRISPR/Cas9の認識配列とDNA二本鎖切断時に標的部位とベクターの切断末端で相補結合するような短い配列を外来遺伝子の両端に付加している。

　ヒトの疾患、特に精神神経疾患のモデル動物としてマウスよりヒトと解剖学的、生理学的、遺伝学的に類似している非ヒト霊長類の疾患モデルが重要である。ゲノム編集技術を用いた標的遺伝子改変非ヒト霊長類の作成には、2014年に3つのグループが成功した<ref><pubmed>24486104</pubmed></ref> <ref><pubmed>24529597</pubmed></ref> <ref><pubmed>24838303</pubmed></ref>[34][35][36]。TALENを用いた[[wj:アカゲザル|アカゲザル]]と[[wj:カニクイザル|カニクイザル]]の[[MECP2]]遺伝子の破壊とCRISPR/Cas9システムを用いたカニクイザルの3つの遺伝子([[Nr0b1]], [[Ppar-,]] [[Rag1]])の破壊が報告された。2015年には、CRISPR/Cas9システムを用い一本鎖のオリゴDNAによる[[p53]]遺伝子への塩基置換が報告された<ref><pubmed>25430965</pubmed></ref>[37]。2018年には、[[mCherry]]やGFPなどの標的部位へのノックインカニクイザルの作成が報告された<ref><pubmed> 29327726</pubmed></ref>　<ref><pubmed>29327727</pubmed></ref>[38][39]。現在までに作成された精神疾患の非ヒト霊長類モデルは、[[レット症候群]]のモデルであるMecP2欠損カニクイザルと[[自閉症スペクトラム障害]]のモデルである[[SHANK3]]欠損カニクイザルがあり、いずれも疾患の症状を再現している<ref><pubmed>28741620</pubmed></ref>　<ref><pubmed>28525759</pubmed></ref>[40][41]。

　生体におけるゲノム編集は、疾患の悪化に関与する遺伝子の破壊あるいは変異遺伝子の修復により、いままで治療法のなかった精神神経疾患に新しい治療法を提供する可能性を持っている。筋ジストロフィーの新しい治療法として、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた[[exon skipping]]（変異のあるエクソンを飛ばして、多少短くなるがある程度機能のある原因遺伝子ジストロフィンを産生させる方法）が注目されている。しかし、exon skippingの効率や副作用など、多くの克服すべき課題が多い。そこで、アンチセンスオリゴヌクレオチドの代わりにCRISPR/Cas9を用いてexon skippingを起こさせる試みがデュシャンヌ型筋ジストロフィー(DMD)のモデルマウスを用いて行われた。米国の3つの研究グループは、ほぼ同時に、CRISPR/Cas9を使ってDMDモデルマウスのジストロフィン遺伝子の変異部分のみを切除し、機能的なジストロフィンを生成させ、筋力を回復させることに成功した<ref><pubmed>26721683</pubmed></ref> <ref><pubmed>26721684</pubmed></ref> <ref><pubmed>26721686</pubmed></ref>[44][45][46]。患者を対象とした臨床治験を始めるには、CRISPR/Cas9の効率向上、骨格筋へのデリバリー法の開発、免疫原性など克服すべき課題も多いが、''in vivo''でのゲノム編集が有効なことを示した成果である。

===== 非相同末端結合を利用した遺伝子ノックイン[47] =====

　DNA二本鎖切断の主要な修復機構の一つであるNHEJによる修復は、細胞周期を通して効率が高いので、神経細胞などの分裂を行っていない細胞にも応用可能である。HITI(homology-independent targeted integration)法は、NHEJを利用した外来遺伝子のノックイン法である。ターゲッティングベクターを作成する際、挿入したい外来遺伝子の隣にノックインしたい標的部位と相同な20塩基対程度の配列を逆向きに付加する。この工夫により、標的部位に外来遺伝子が正しくノックインされない場合、Cas9によるDNA二本鎖切断が繰り返され、結果的にノックイン効率が向上する。HITI法を利用することにより、成体マウスの様々な臓器に外来遺伝子をノックインすることが可能になった。この方法を用い、[[網膜色素変性症]]モデルラットの疾患原因遺伝子が修復され、視覚障害の部分的な回復が見られた<ref><pubmed>27851729</pubmed></ref>[47]。この方法の欠点は、挿入部位周辺に塩基欠損や挿入を伴うこととターゲッティングベクターの余分な配列が挿入されことである。

　最近、挿入する外来遺伝子をアデノ随伴ウイルスベクターを用い脳に導入することにより、相同組換えによるノックイン効率が高くなることが報告された<ref><pubmed>29056297</pubmed></ref>[48]。標的部位のDNA二本鎖切断に必要なガイドRNA、Cas9のcDNA、相同性を持つ外来遺伝子をアデノ随伴ウイルスベクターに組み込み、脳へ局所注入することにより、HITI法と同等な効率で狙った部位に遺伝子をノックインできる。