「ゲノム編集」の版間の差分

　このクローニングフリーCRISPR/Cas9システムは、ガイドRNAの活性評価も簡便である。従来のような培養細胞を用いた実験は必要なく、試験管内で標的配列を含む[[PCR]]産物、Cas9蛋白質、crRNA、tracrRNAをインキュベートして電気泳動するだけで（''in vitro'' digestion assay：IDA）、その切断活性を調べることができる。クローニングフリーCRISPR/Cas9システムを用い、ActB (β-actin)遺伝子座に[[EGFP]]（enhanced green fluorescent protein）を含む2.5 kbの外来遺伝子をノックインするマウスを作成したところ、およそ50%の新生仔マウスにEGFPが目的部位にノックインされていた。従来用いられてきたCas9 mRNAとsgRNAからなる2要素システムを用い対照実験を行ったところ、その効率は10%程度だった。このことからクローニングフリーCRISPR/Cas9システムは、外来遺伝子のノックイン効率を大幅に向上させることが明らかになった<ref name=Aida2015/>[30]。さらに作製したノックインマウスを野生型マウスと交配し、次世代への伝達効率を調べたところ、すべての系統から、50%の効率で次世代のノックインマウスが得られた。このことは、従来型CRISPR/Cas9システムで問題となるモザイク（同一個体内の一部の細胞のみに遺伝子改変が起こっている）の頻度が低いことを示している。つまり、クローニングフリーCRISPR/Cas9システムでは、標的部位のDNA二本鎖切断が迅速に起こり、受精卵の第一卵割までに片アリルに外来遺伝子がノックインされたことを示している。またオフターゲット変異の候補となる部位を解析したところ、いずれのノックインマウスでも変異は検出されなかった。このことは、クローニングフリーCRISPR/Cas9システムでは、Cas9を蛋白質として注入したことによりCas9の半減期が短くなり、標的部位を切断した後迅速に分解されるため、従来型CRISPR/Cas9システムの大きな課題であるオフターゲット変異（ガイドRNA配列に類似した配列の非特異的切断）が大幅に減少することを示している。

　クローニングフリーCRISPR/Cas9システムを用いた外来遺伝子ノックインマウス作成法の欠点は、煩雑なターゲッティングベクターの作成が必要な点である。その点を改良したのが、[[PITCh]]([[Precise Integration into Target Chromosomes]])法である（'''図6'''）<ref><pubmed> 25410609</pubmed></ref>[32]。PITCh法は、相同組換やNHEJと異なるDNA二本鎖切断の修復機構である[[マイクロホモロジー媒介末端結合]]([[microhomology mediated end-joining]]; [[MMEJ]])を利用した外来遺伝子のノックイン法である。MMEJは、DNA二本鎖切断の際に生じた切断末端間で、相補的配列（5〜25塩基対）同士で結合し、DNA二本鎖切断を修復する機構である。従来の相同組換えを利用した遺伝子挿入法では、挿入効率を上げるため外来遺伝子の両側に500〜1000塩基対の相同配列を付加したターゲッティングベクターを作成する必要があった。しかし、PITCh法では相同配列の長さが約20塩基対でよく、ターゲッティングベクターの作成が簡便化される。PITCh法では、ターゲッティングベクターにCRISPR/Cas9の認識配列とDNA二本鎖切断時に標的部位とベクターの切断末端で相補結合するような短い配列を外来遺伝子の両端に付加している。