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===== 相同組換えを利用した遺伝子ノックイン ===== | ===== 相同組換えを利用した遺伝子ノックイン ===== | ||
神経細胞は分裂を行っていない細胞なので、相同組換えを利用した遺伝子ノックインをすることは困難であった。これを克服する方法として[[single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair法|single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair]] ([[SLENDR法|SLENDR]])法が開発された<ref name=mikuni2016><pubmed>27180908</pubmed></ref>。SLENDR法では、分裂能を持つ神経前駆細胞に、標的部位のDNA二本鎖切断に必要なガイドRNA、Cas9のcDNA、相同性を持つ外来遺伝子を子宮内電気穿孔法を用い導入する。この方法を用い標的遺伝子にタグ配列を挿入することができ、免疫組織化学に適した抗体のない遺伝子でもその局在を解析することができる。 | |||
さらに最近、挿入する外来遺伝子をアデノ随伴ウイルスベクターを用い脳に導入することにより、相同組換えによるノックイン効率が高くなることが報告された<ref><pubmed>29056297</pubmed></ref>。標的部位のDNA二本鎖切断に必要なguide RNA、Cas9のcDNA、相同性を持つ外来遺伝子をアデノ随伴ウイルスベクターに組み込み、脳へ局所注入することにより、HITI法と同等な効率で狙った部位に遺伝子をノックインできる。 | さらに最近、挿入する外来遺伝子をアデノ随伴ウイルスベクターを用い脳に導入することにより、相同組換えによるノックイン効率が高くなることが報告された<ref><pubmed>29056297</pubmed></ref>。標的部位のDNA二本鎖切断に必要なguide RNA、Cas9のcDNA、相同性を持つ外来遺伝子をアデノ随伴ウイルスベクターに組み込み、脳へ局所注入することにより、HITI法と同等な効率で狙った部位に遺伝子をノックインできる。 |