「ナノボディ」の版間の差分

 

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　ウサギ、マウスなどに見られる一般的な抗体は重鎖と軽鎖からなる複合体であり、研究、診断、治療などには、IgG、IgMなどの免疫グロブリンとその誘導体（Fab断片など）が広く用いられている（図１）。最も一般的な抗体分子IgGは、別々の可変領域（Variable region）ドメインを持った重鎖と軽鎖からなるヘテロダイマーが１つの抗原を認識し、重鎖の定常領域（Constant region）ドメインを介したジスルフィド結合で、もう一つの同じ重鎖と軽鎖 のヘテロダイマーと一緒になって、分子量150kDaほどのY字型のヘテロテトラマーとなっている。また目的に応じて、 抗原との結合能を維持した小型抗体分子、例えばFab（1つの軽鎖および半分の重鎖） のようなプロテアーゼ断片や、重鎖と軽鎖の可変領域ドメインを組換えDNA技術で人工的に接続することで、一本鎖の可変断片からなる単鎖抗体（single chain antibody）がしばしば利用されてきた。

一方、1993年、ヒトコブラクダは、 例外的に軽鎖がない重鎖のみでできた特殊な抗体（重鎖抗体Heavy chain antibodies ）も持っていることが、Hamers-Castermanらによって報告された。 これは、現存するラクダ科（ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、リャマ/グアナコ、アルパカ/ビクーニャ）の動物に共通して見られる抗体である。その後、 軟骨魚（サメ、ギンザメなど）でも類似した重鎖抗体の存在が確認された。

ナノボディの情報を系統的に収集してきている中国の南京にある東南大学のiCAN (Institute Collection & Analysis of Nanobody, http://ican.ils.seu.edu.cn)には、2018年8月現在、約2400のナノボディ配列が登録されている。

しかしながら、通常の免疫グロブリンの可変領域とは異なる特徴が見られ、それがナノボディの長所ともなっている。第１に、通常の免疫グロブリンに比べて、FR2領域に親水性のアミノ酸残基が多く、ナノボディの水溶性の性質や安定性を高めている。第２に、 通常の免疫グロブリンの6つのCDR（重鎖3つ、軽鎖3つ）の代わりに3つのCDRのみで抗原と結合する。その結果、認識に必要な構造（paratope パラトープ）が小さいので、通常の免疫グロブリンが入り込めないような抗原の構造（epitope エピトープ）を認識できる可能性がある。（Genst et al., 2006）。第３に、通常の抗体より長いCDR1, CDR3ループを持つために、結合の親和性や特異性を高めることが可能となっている。これらの水溶性、構造的なコンパクトさ、そして超可変領域の配列の多様性が、ナノボディの利点となると考えられる。

一般的な方法としては、重鎖抗体を産生する動物を飼育し、それを抗原で免疫することである。 比較的小型のリャマ Lama glamaのほかに、アルパカVicugna pacos、ヒトコブラクダCamelus dromedarius、ネコザメ Heterodontus francisci が免疫に利用されている。次に免疫動物から血液を採集し、その中にあるB細胞から、可変領域を含むcDNAライブラリーを作製、そのライブラリーを固定化した抗原を使ったファージディスプレイなどのパニングでスクリーニングすることで、cDNA配列を単離し、抗原に結合するナノボディ配列を知ることができる。(Pardon)

特に、最近、これらの方法を組み合わせることで、効率的に行う戦略が考案されている。Fridayらは、免疫動物の結合抗体を精製しその質量スペクトルの結果とファージディスプレイのハイスループットな配列決定を組み合わせる方法で、多数の蛍光タンパク質に結合するナノボディを報告した。Zimmermann は、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、ELISAを組み合わせることで、短期間にナノボディ配列を得る戦略を報告している。また、McMahon らは、酵母ディスプレイを用いて、免疫動物を用いない合成ライブラリーをスクリーニングすることで親和性の高いナノボディ配列を得ることができることを示している。このような非免疫ライブラリーや合成ライブラリーを用いる方法については、まだ適用例が少なく、標準的な方法とされるものが存在しないというのが実情であろう。また、ある程度の抗原親和性を示すナノボディの配列を調整することで、親和性の成熟affinity maturationを行うこともできる。  

=１）化学的カップリング=

=2) ランボディRANbody=

 

=３）免疫沈降=

=４）イントラボディ、クロモボディ=

Chromobodyは、ナノボディをGFPなどの蛍光タンパク質と結合することで、標的分子に結合し、標的分子の染色や追跡が可能になる方法である。例えば、アクチンに対するナノボディをGFPと融合させ、それを細胞内で発現させれば、アクチンがナノボディを介してGFPで標識される。この融合する蛍光タンパク質をSTORM, PALMなどの高解像度顕微鏡 に利用できるものとすれば、高解像度のバイオイメージングが可能になる。

=５） 分子間相互作用（[[PPI]])研究への利用=

ナノボディは、分子間相互作用（PPI)の研究ツールとしても有用である。１つの有力な方法は、イントラボディとして発現させ、FRET、LRETといったPPIを検出するための方法と組み合わせたバイオイメージングである。

フィブロネクチン中の代表的なモチーフであるtype IIIリピートは、免疫グロブリンドメインと構造が類似しており、これを他の分子に結合する免疫グロブリンのように改変することが可能であり、この方法は、モノボディ（monobody）と名付けられている（Koide e tal., 2013)。 ジスルフィド結合によって構造が左右されないので、 細胞内での還元状態の環境でも利用できる。例えば、Arnoldのグループによって開発されたFingRは、[[PSD]]95やゲフィリンといったシナプスタンパク質を認識することができる（Gross et al. 2013)。

免疫グロブリンを利用しない組み換え結合体には、このほかにも、アンキリンリピートを利用したDARPins（Designed ankyrin repeat proteins)などの方法がある(Helma et al., 2015; Plückthun2015)。