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シングルセルRNAシーケンシング (ソースを閲覧)

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その後、5’末端側も含めた完全長cDNAを増幅するscRNA-seqのプロトコールが考案された。特に、SMART-seq（Switch mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコルであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある[https://doi.org/10.1101/817924]）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>がある。更に、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref>では、T7 RNAポリメラーゼによるin vitro転写を用いることにより、PCRで顕著な増幅バイアスを減少させようとしている。
その後、5’末端側も含めた完全長cDNAを増幅するscRNA-seqのプロトコールが考案された。特に、SMART-seq（Switch mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコルであるSMART-seq2<ref><pubmed>24056875</pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>の使用例が多い（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもある[https://doi.org/10.1101/817924]）。また、類似法としてSTRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref>がある。更に、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed>24531970 </pubmed></ref>、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref>では、T7 RNAポリメラーゼによるin vitro転写を用いることにより、PCRで顕著な増幅バイアスを減少させようとしている。


増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いる方法である<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref><ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダムなUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。2013年には、このような１細胞のシーケンシング技術が、Nature Methods誌のMethod of the Year に選ばれた[https://www.nature.com/collections/mysbdwgfll]。
増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いる方法である<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダムなUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。2013年には、このような１細胞のシーケンシング技術が、Nature Methods誌のMethod of the Year に選ばれた[https://www.nature.com/collections/mysbdwgfll]。


これらの方法のうち、SMART-seq、その改良法であるSMART-seq2は、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、レーザー捕獲などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路製作技術で作った流体集積回路を利用するFluidigm C1の装置[https://jp.fluidigm.com]と組み合わせることで利用される機会が多い<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。このSMART-seq2プロトコールの特徴は、全長トランスクリプトームを得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、アリルごとの発現情報が得られるSNPs、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、別の細胞の反応と混じる可能性がない。これらの点が、次に説明するDropletを使用して3’末端のみを標的にしたscRNA-seqに比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。
これらの方法のうち、SMART-seq、その改良法であるSMART-seq2は、マイクロピペットによる捕獲、セルソーター、レーザー捕獲などを用いるマルチウェル法、あるいは半導体集積回路製作技術で作った流体集積回路を利用するFluidigm C1の装置[https://jp.fluidigm.com]と組み合わせることで利用される機会が多い<ref><pubmed>30405621</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/742304]。このSMART-seq2プロトコールの特徴は、全長トランスクリプトームを得ることができることであり、mRNAのスプライシングバリアントなどのアイソフォーム、アリルごとの発現情報が得られるSNPs、変異の検出にも利用できる。また、それぞれ細胞ごとの反応を独立した場所で行うため、別の細胞の反応と混じる可能性がない。これらの点が、次に説明するDropletを使用して3’末端のみを標的にしたscRNA-seqに比べた場合の長所であるが、その高コスト（1細胞あたり数十ドル）と処理可能な細胞数の少なさが短所である。
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===神経系へのscRNA-seqの適用===
===神経系へのscRNA-seqの適用===
大脳皮質には、錐体細胞や非錐体細胞などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のscRNA-seq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のDroplet使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref><の理解が、scRNA-Seq技術を利用することで進んでいる。更に、神経活動によって変化するトランスクリプトームの変化も細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> 。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNA-seqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/709501。ヒトや霊長類に特徴的とされる島のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNA-seqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。
大脳皮質には、錐体細胞や非錐体細胞などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のscRNA-seq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のDroplet使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref><の理解が、scRNA-Seq技術を利用することで進んでいる。更に、神経活動によって変化するトランスクリプトームの変化も細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> 。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNA-seqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/709501。ヒトや霊長類に特徴的とされる島のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNA-seqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。


海馬<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、外側膝状体<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、大脳基底核(足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、視床下部<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref>  <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>  <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、線条体<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、中脳<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref>  <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、手綱<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の間脳<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに小脳<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><<ref><pubmed>30735127</pubmed></ref>ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が得られている。マウスの小脳においては、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違った２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。
海馬<ref><pubmed>29241552</pubmed></ref><ref><pubmed>29912866</pubmed></ref><ref><pubmed>29335606</pubmed></ref><ref><pubmed>31942070</pubmed></ref>では、これまでの研究で記載されてきた神経細胞のタイプの存在が確認され、更に新規のタイプが見つかった。中枢神経系では、その他、外側膝状体<ref><pubmed>29343640</pubmed></ref>、大脳基底核(足底核)<ref><pubmed>28384468</pubmed></ref> 、視床下部<ref><pubmed>28166221</pubmed></ref><ref><pubmed>28355573</pubmed></ref>  <ref><pubmed>27991900</pubmed></ref><ref><pubmed>30385464</pubmed></ref>  <ref><pubmed>31249056</pubmed></ref><ref><pubmed>30858605</pubmed></ref>、線条体<ref><pubmed>27425622</pubmed></ref><ref><pubmed>30134177</pubmed></ref><ref><pubmed>31875543</pubmed></ref>、中脳<ref><pubmed>27716510</pubmed></ref><ref><pubmed>29499164</pubmed></ref>  <ref><pubmed>30718509</pubmed></ref> 、手綱<ref><pubmed>29576475</pubmed></ref>、発生中の間脳<ref><pubmed>30872278</pubmed></ref> 、さらに小脳<ref><pubmed>30220501</pubmed></ref><ref><pubmed>30735127</pubmed></ref><ref><pubmed>30690467</pubmed></ref>などの結果が得られている。マウスの小脳においては、分子層にこれまでの星状細胞、バスケット細胞というカテゴリーとは違った２種類の神経細胞があることが示唆されている[https://doi.org/10.1101/2020.03.04.976407]。


脳の外部では、感覚神経<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、らせん神経節<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、臭覚神経<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、腸神経系 <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757]　、網膜<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][ https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555][A]でのscRNA-seqデータがある。またiPS細胞やES細胞由来のオルガノイドに含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref>。
脳の外部では、感覚神経<ref><pubmed>25420068</pubmed></ref><ref><pubmed>26691752</pubmed></ref>、らせん神経節<ref><pubmed>30078709</pubmed></ref><ref><pubmed>30209249</pubmed></ref> 、臭覚神経<ref><pubmed>26541607</pubmed></ref> <ref><pubmed>32059767</pubmed></ref>、腸神経系 <ref><pubmed>29483303</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.02.955757]　、網膜<ref><pubmed>27565351</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref><ref><pubmed>30018341</pubmed></ref><ref><pubmed>31260032</pubmed></ref><ref><pubmed>31128945</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref><ref><pubmed>30548510</pubmed></ref><ref><pubmed>31075224</pubmed></ref><ref><pubmed>31399471</pubmed></ref><ref><pubmed>31848347</pubmed></ref><ref><pubmed>31673015</pubmed></ref><ref><pubmed>31653841</pubmed></ref><ref><pubmed>31784286</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.02.26.966093][ https://doi.org/10.1101/779694][https://www.biorxiv.org/content/10.1101/617555][A]でのscRNA-seqデータがある。またiPS細胞やES細胞由来のオルガノイドに含まれる神経細胞タイプを知る上でも利用されている<ref><pubmed>28094016</pubmed></ref><ref><pubmed>28279351</pubmed></ref><ref><pubmed>31168097</pubmed></ref><ref><pubmed>31996853</pubmed></ref><ref><pubmed>31968264</pubmed></ref>。
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==scRNA-seqの展望==
==scRNA-seqの展望==
===神経系の多様性と進化===
===神経系の多様性と進化===
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNA-seqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、センチュウ<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref>、ショウジョウバエ  <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[A]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNA-seqのデータ解析は困難を伴うので、NCBIのTaxonomy[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy]やEggNOG [http://eggnogdb.embl.de] <ref><pubmed>30418610</pubmed></ref>などを利用する。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>
NGSを用いることで、どんな生物種にも適用可能なscRNA-seqは、既に多様な生物の神経系の細胞の理解、更には種間の相同性や差異の研究に利用されており、神経系の進化を細胞レベルで考察するのに有用であろう（例、センチュウ<ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>、ショウジョウバエ  <ref><pubmed>29909982</pubmed></ref><ref><pubmed>29149607</pubmed></ref><ref><pubmed>30703584</pubmed></ref><ref><pubmed>29909983</pubmed></ref>、カタユウレイボヤCiona intestinalis <ref><pubmed>30069052</pubmed></ref><ref><pubmed>30228204</pubmed></ref>、ゼブラフィッシュ<ref><pubmed>31018142</pubmed></ref><ref><pubmed>30929901</pubmed></ref>、アカミミガメTrachemys scripta elegans、トカゲPogona vitticeps, pv<ref><pubmed>29724907</pubmed></ref>、ニワトリ[A]、霊長類<ref><pubmed>30730291</pubmed></ref><ref><pubmed>31619793</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972]）。ただ、遺伝子やトランスクリプトームの研究が進んでいる生物種では比較的容易であるが、遺伝子のアノテーションが十分でない生物種を用いる場合、scRNA-seqのデータ解析は困難を伴うので、NCBIのTaxonomy[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy]やEggNOG [http://eggnogdb.embl.de] <ref><pubmed>30418610</pubmed></ref>などを利用する。また種を超えた細胞タイプの相同性の理解には様々な工夫が必要である<ref><pubmed>31552245</pubmed></ref><ref><pubmed>30712875</pubmed></ref>


===データベースと統合===
===データベースと統合===
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