「シングルセルRNAシーケンシング」の版間の差分

シングルセルRNAシーケンシング(single-cell RNA sequencing, 以下scRNAseq)は、[[次世代シーケンサー]] （next generation sequencer、以下NGS）を用いることで、個々の細胞が保持しているmRNA全体を質的、量的に網羅的に調べる方法である。次元圧縮などの数理的な解析と組み合わせることで、遺伝子発現の状態に基づいた細胞の分類を行うことが可能であり、従来の組織学的、あるいは細胞生物学的手法では知られなかった新規の細胞種の同定や細胞状態の推定を行うことが可能になった。また、遺伝子発現プロファイルの変化に基づく擬時系列解析によって、刺激や発生に伴う細胞状態の遷移の描写ができる。神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、新しい神経細胞タイプ、細胞マーカー、病態の理解、更に機能的な遺伝子の同定などが系統的かつ網羅的に行われるようになった。scRNAseqに、空間的情報、エピゲノム情報、タンパク質情報なども取り入れた複数のモダリティを考慮した研究も行われている。

一方で多くの種類のmRNAを１細胞レベルで一挙に観察するための技術には感度やスループット、そしてコストの観点からブレークスルーが待たれた。1つの問題は多種類のcDNAを簡便に識別することを可能にする方法の開発であった。これを可能にしたのが、[[PCR]]などのcDNA増幅法の改良とマイクロアレイの利用であった<ref><pubmed>12736331</pubmed></ref><ref><pubmed>16547197</pubmed></ref>。しかしながら、細胞ごとに高価なマイクロアレイを使用することは、多数の細胞のトランスクリプトームの観察には限界があった。2009年になると、これらの問題を解決できる可能性として、NGSを利用するscRNAseqプロトコールがAzim Suraniのグループによって報告された<ref><pubmed>19349980</pubmed></ref>。しかしながら、多数のマイクロアレイでなく1回のNGS使用で済ませることができるものの、この報告でもわずか8個の細胞の解析に留まっており、1つの細胞ごとに処理を行うという操作が必要で、多数の細胞についてのトランスクリプームを一挙に理解することはできなかった。また、塩基配列の違うcDNAごとにPCR効率に差がある結果生じる増幅バイアス、また3’末端側が選択的に補足されることなどの課題があった。

===scRNAseqの分子生物学的反応===

増幅バイアス除去のアプローチとして特に重要なのは、2011年に発表された方法で、分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させ、NGS後の情報処理を用いるものであると考えられる<ref><pubmed>22101854</pubmed></ref>。この方法では逆転写反応の際、ランダム塩基配列から構成されるUMIをcDNA末端に付加した後、増幅反応、NGSを行い、cDNA配列とUMI配列の両方を読む。cDNAにはRNA1分子に1つのUMIが付加されるので、同一のUMIを持っていれば、逆転写時に同一のcDNA由来とカウントする。UMIをカウントすることで、増幅前のmRNAのコピー数を知ることができる<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref><ref><pubmed>24363023</pubmed></ref><ref><pubmed>28192419</pubmed></ref> <ref><pubmed>29474909</pubmed></ref><ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref><ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>。

なお、DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropsはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することにより、低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利であるとされる<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。DropSeqのセットアップはDolomite Bio ([https://www.dolomite-bio.com])、inDropは1 Cellbio社から販売されている[https://1cell-bio.com]。しかし、その後、10x Genomics社が同様の原理を用いた「Chromium」と命名された機器とそのための試薬を市販することで、多くの研究者が容易に利用できるようになっている<ref><pubmed>28091601</pubmed></ref>[https://www.10xgenomics.com/jp/]。Svenssonらによる最近のデータベース[https://doi.org/10.1101/742304], [http://www.nxn.se/single-cell-studies/gui]では、scRNAseqを用いた論文で用いられた方法について調査している。この数年、10x Genomics社Chromiumを用いた論文が飛躍的に増加している。10x Genomics社Chromiumのシステムは市販であるので導入が容易であり、DropSeqやinDropsに比べ多くの転写産物の検出が可能であるが、それらよりランニングコストは高価である<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。なお、3’エンドリード法だけでなく、抗体やT 細胞レセプターのN末端側に位置する可変領域の配列決定が可能である5'末端のシーケンシングには5’エンドリード法が利用されることがある。

ここでは主流になっている10x Genomics社のChromiumなどのドロップレットを用いた方法とSMART-seqなどを用いた方法に共通する方法の実際について概説する。scRNAseqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed> 31217225</pubmed></ref><ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別に解離された状態にすること。２）ドロップレット法やSMART-seq対応のプラットフォームなどによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGS。３）得られた配列情報の前処理（preprocessing）。４）下流解析と生物学的な情報を得るコンピューター生物学。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、詳細は説明しない

単離した細胞は、そのまま10x GenomicsのChromiumのプラットフォームに導入することができるが、細胞表面分子マーカーに対する抗体や蛍光タンパク質レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS(磁気ビーズカラム)などによって、細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記の複数モダリティのオミクスの項目で述べる。

scRNAseq解析のためには、数多くのツールが公開されている。これらのツールは、バージョンが変わったり、新しいものに置き換えられることがあるので、実際に利用する場合は最新の動向に注意を払う必要がある。scRNAseqの解析に必要なツールは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]などで紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、bioRxivなどの査読前のプレプリントサーバで公開されて、随時試用、評価されていくものが多く、scRNAseqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。

[[大脳皮質]]には、[[錐体細胞]]や[[非錐体細胞]]などの神経細胞や様々なグリア細胞などが見られ、古くから神経細胞タイプの識別が行われてきた。初期のFluidigm C1を用いたscRNAseq技術でも、マウス皮質の小規模な細胞数を分類した研究で、これまで知られていた主要な神経細胞タイプとは違うタイプが見つかりその有効性が示された<ref><pubmed>25700174</pubmed></ref>。その後のドロップレット使用の3’エンドリード法を利用した多数の細胞数の解析で、更に多数の神経細胞のタイプが見つかっている<ref><pubmed>32839617</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30096299</pubmed></ref><ref><pubmed>30096314</pubmed></ref><ref><pubmed>30382198</pubmed></ref><ref><pubmed>29320739</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.14.991018][https://doi.org/10.1101/2020.06.04.105700] [https://doi.org/10.1101/2020.07.02.184051]。特に、GABA作動性介在神経細胞タイプの多様性とその発生<ref><pubmed>28942923</pubmed></ref><ref><pubmed>28134272</pubmed></ref><ref><pubmed>29472441</pubmed></ref><ref><pubmed>29513653</pubmed></ref>についての、これまでの組織化学的な研究からは得られていなかった多くの情報は重要であろう。また、初期の発生過程<ref><pubmed>26940868</pubmed></ref><ref><pubmed>30485812</pubmed></ref><ref><pubmed>31073041</pubmed></ref><ref><pubmed>30635555</pubmed></ref><ref><pubmed>30625322</pubmed></ref>、老化<ref><pubmed>31551601</pubmed></ref>の理解が、scRNASeq技術を利用することで進んでいる。更に、[[神経活動]]や[[臨界期]]に伴い変化するmRNAも細胞ごとに調査され興味深い<ref><pubmed>29230054</pubmed></ref> <ref><pubmed>32404418</pubmed></ref>。 ヒトを含めた霊長類の大脳についても発達段階を含めてscRNAseqが適用されてきている<ref><pubmed>26060301</pubmed></ref><ref><pubmed>27339989</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29227469</pubmed></ref><ref><pubmed>31303374</pubmed></ref><ref><pubmed>29867213</pubmed></ref><ref><pubmed>31435019</pubmed></ref><ref><pubmed>32424074</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/709501][https://doi.org/10.1101/2020.03.31.016972][https://doi.org/10.1101/2020.04.23.056390]。ヒトや霊長類に特徴的とされる[[島]]のvon Economo神経細胞（紡錘細胞）のような希少な神経細胞のscRNAseqにも成功している<ref><pubmed>32127543</pubmed></ref>。

多数の細胞を扱うscRNAseqの弱点は、組織から細胞や細胞核を解離する必要があるので、その細胞が存在していた解剖学的あるいは空間的な位置の情報を消去してしまうということである。組織切片におけるタンパク質などの分布は免疫組織化学、mRNAの分布はin situ hybridizationで検出することができるが、数多くのmRNAの分布を情報処理技術と組み合わせ一気に同定する方法がscRNAseqと同様に開発されてきている（Slide-seq<ref><pubmed>30923225</pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.03.12.989806]、HDST<ref><pubmed>31501547</pubmed></ref>、Expansion sequencing[http://doi.org/10.1101/2020.05.13.094268]など<ref><pubmed>27365449</pubmed></ref>, <ref><pubmed>31932730</pubmed></ref> <ref><pubmed>30948552</pubmed></ref>）、更に10x Genomics社が市販するVisiumなどがある。現状では、大きな組織の空間トランスクリプトミクスは、空間解像度は限定されており、技術普及の観点からも課題が多い。しかし、そのデータを解析するためのアルゴリズム<ref><pubmed>29553578</pubmed></ref><ref><pubmed>29553579</pubmed></ref><ref><pubmed>32350282</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/757096][https://doi.org/10.1101/701680] [https://doi.org/10.1101/431957]、