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== 発見の経緯とその後 == | == 発見の経緯とその後 == | ||
ADPリボシル化因子(Arf)は、コレラ毒素Aサブユニットによるヘテロ三量体Gタンパク質GsのADP-リボシル化に必要な補因子として、ウサギ肝臓とウシ脳から精製された<ref name=Enomoto1980><pubmed>6766444</pubmed></ref><ref name=Kahn1984><pubmed>6327671</pubmed></ref><ref name=Schleifer1982><pubmed>6273425</pubmed></ref>。精製されたArf自体がGTP結合能を持ち<ref name=Kahn1986><pubmed>3086320</pubmed></ref>、さらにSewellとKahn (1988年) <ref name=Sewell1988><pubmed>3133654</pubmed></ref>によりクローニングされたウシArf1の一次構造から、Rasや三量体Gタンパク質Gsと相同性の高い配列を持つ低分子量GTP結合タンパク質であることが明らかになった。その後、哺乳類ではArf1-Arf6の6分子（ヒトでは5分子）のパラログの存在が明らかになっている<ref name=Hosaka1996><pubmed>8947846</pubmed></ref>。 | |||
「ADPリボシル化因子」の名称は、試験管内でのコレラ毒素の補酵素としての性質に由来するもので、生理的な機能を反映するものではない。細胞内において、Arfは小胞輸送やアクチン細胞骨格の制御に関わる低分子量GTP結合タンパク質として機能している。コレラ毒素のADPリボシル化の補酵素としての性質に基づいたArfの本来の定義に該当する分子はArf1-Arf6の6分子（ヒトでは5分子）のみであるが、近年、Arl (Arf-like)、ARFRP１(Arf-related protein 1)、SAR1などの近縁分子が多数同定され、Arfスーパーファミリーとして広がりつつある。 | 「ADPリボシル化因子」の名称は、試験管内でのコレラ毒素の補酵素としての性質に由来するもので、生理的な機能を反映するものではない。細胞内において、Arfは小胞輸送やアクチン細胞骨格の制御に関わる低分子量GTP結合タンパク質として機能している。コレラ毒素のADPリボシル化の補酵素としての性質に基づいたArfの本来の定義に該当する分子はArf1-Arf6の6分子（ヒトでは5分子）のみであるが、近年、Arl (Arf-like)、ARFRP１(Arf-related protein 1)、SAR1などの近縁分子が多数同定され、Arfスーパーファミリーとして広がりつつある。 | ||
== ファミリー構成分子 == | == ファミリー構成分子 == | ||
哺乳類のArfファミリーは、異なる遺伝子から生じる６種のパラログ(Arf1-6)からなる<ref name=Hosaka1996><pubmed>8947846</pubmed></ref>。ただし、ヒトARF2は偽遺伝子化しタンパク質として存在しない。６種のArf分子は一次配列とゲノム構造の類似性から３つのクラスに分類され、クラスIにはArf1, Arf2, Arf3、クラスIIにはArf4, Arf5、クラスIIIにはArf6が属する。クラスIは181アミノ酸、クラスII は180アミノ酸、唯一クラスIIIに属するArf6は175アミノ酸からなる。マウスArfにおいて同一クラス間で90-96%, クラスIとクラスII間では78-81%、クラスI/IIとクラスIII間では65-69%のアミノ酸の同一性がある。なお、記載法として、「ARF」はヒトの遺伝子あるいはタンパク質に対して使われ、「Arf」はヒト以外の種での名称、総称、活性などに対して用いられることが推奨されている<ref name=Kahn2006><pubmed>16505163</pubmed></ref>。 | |||
== 構造 == | == 構造 == | ||
Arfは、低分子量GTP結合タンパク質に共通の構造として、GTPおよびGDPとの結合により大きく立体構造を変化させてGTP依存的にエフェクターと相互作用するスイッチIとスイッチII領域を持つ<ref name=Gillingham2007><pubmed>17506703</pubmed></ref><ref name=Pasqualato2001><pubmed>11266366</pubmed></ref>。さらに他の低分子量GTP結合タンパク質とは異なる特徴として、N末端の開始メチオニン残基が除去され、2番目のグリシン残基に14炭素鎖飽和脂肪酸のミリスチン酸(C14:0)が不可逆的にアミド結合で付加されている。さらにそれに続くN末端領域に両親媒性αヘリックス領域が存在し、Arfの脂質膜との相互作用とともにスイッチIとスイッチII領域の構造変化に関わる。脂質膜と相互作用するN末端領域とエフェクターと相互作用するスイッチ領域間の立体構造上の距離が短い(1~2nm)ため、他の低分子量GTP結合タンパク質に比べて、エフェクターは脂質膜のより近くにリクルートされ作用する。これらの性質はArfの下流エフェクターであるリン脂質代謝酵素やアダプタータンパク質によるリン脂質膜への作用を介した小胞輸送制御に密接に関連すると考えられている<ref name=Gillingham2007><pubmed>17506703</pubmed></ref>。さらにGDP結合型とGTP結合型への変換に伴いスイッチIとスイッチII領域を繋ぐインタースイッチ領域も大きく立体構造を変化させるのもArfの構造上の特徴として挙げられる。 | |||
== 下流エフェクター == | == 下流エフェクター == | ||
他の低分子量GTP結合タンパク質と同様に、GTP結合型Arfは活性型として、種々のエフェクターを細胞膜や細胞小器官の脂質膜マイクロドメインにリクルートし、小胞輸送経路やアクチン細胞骨格の再構築を促す<ref name=D'Souza-Schorey2006><pubmed>16633337</pubmed></ref><ref name=Donaldson2011><pubmed>21587297</pubmed></ref>。多数のエフェクター分子が同定されており、それぞれArf分子に対する選択性を持つが、主要なエフェクターとして、①コートタンパク質（COPI複合体、GGA(Golgi-localized, -ear-containing, Arf-binding protein)、アダプタータンパク質複合体(AP-1, 2, 3, 4）、②リン脂質修飾酵素（ホスホリパーゼD、ホスファチジルイノシトール 4-リン酸 5-キナーゼ (PIP5K)、ホスファチジルイノシトール 4-キナーゼ）、③モータータンパク質（MKLP1）とアダプター分子（FIP3/4, JIP3/4）、④小胞繋留因子 (エクソシスト複合体サブユニットSec10、ゴルジンGMAP210、GARP/EARP複合体サブユニットVps52)などが挙げられる。また、GDP型Arfに選択的に結合する分子も同定されており、例えばGDP結合型Arf6の場合、アダプタータンパク質Fe65<ref name=Cheung2014><pubmed>24056087</pubmed></ref>、Rac/Rho-GEFであるKalirin <ref name=Koo2007><pubmed>17640372</pubmed></ref>、Rab-GAPであるTBC1D24 <ref name=Falace2010><pubmed>20727515</pubmed></ref>などが挙げられる。これらの事実から、古典的なGDP-GTPサイクルのドグマにおいて不活性型とされるGDP型Arfが、シグナル経路の調節に積極的に関与している可能性が示唆される。 | |||
== 細胞内局在 == | == 細胞内局在 == | ||
Arfは様々な組織に幅広く発現する<ref name=Hosaka1996><pubmed>8947846</pubmed></ref>。内因性Arfの細胞内局在は、分子間の高い同一性から特異的な抗体の作製が難しく、依然明らかにされていない。培養細胞への強制発現系を用いた局在解析から、Arf1-5は小胞体、ゴルジ装置、エンドソームに主に局在するのに対して、Arf6は細胞膜とエンドソームに局在することが報告されている<ref name=D'Souza-Schorey2006><pubmed>16633337</pubmed></ref><ref name=Radhakrishna1997><pubmed>9314528</pubmed></ref>。CRISPR-Cas9を用いたゲノム編集技術によりクラスI Arf (Arf1, Arf3)とクラスII Arf (Arf4, Arf5)のC末領域にタグをノックインした内因性Arfタンパク質の細胞内局在に関する超解像度顕微鏡解析の報告によると、HeLa細胞において、クラスIとクラスII Arfとも小胞体–ゴルジ体中間区画（ERGIC）、ゴルジ装置、管状小胞状の構造に部分的に共存しながら分布するが、同じ細胞小器官において異なるナノドメインへの局在も示すことから、クラスIとII のArfの各分子は、重複する機能とともに特異的な機能を持つものと考えられる<ref name=Wong-Dilworth2023><pubmed>37102998</pubmed></ref>。 | |||
== 活性化制御 == | == 活性化制御 == | ||
ArfのGDP-GTPサイクルはグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)とGTPase活性化因子(GAP)により厳密に調節されている。 | |||
Arf-GEFは、1996年に酵母からGea1が、哺乳類からサイトヘジン-2 (ARNO)とBIG１のcDNAが最初にクローニングされた<ref name=Chardin1996><pubmed>8945478</pubmed></ref><ref name=Peyroche1996><pubmed>8945477</pubmed></ref>。その一次構造の比較から、GDPからGTPへの交換活性に必須である約200アミノ酸からなるSec7ドメインの存在が明らかになった。Sec7ドメインを持つタンパク質は、ヒトでは15種存在し、ドメイン構造の特徴から、GBF1ファミリー, BIGファミリー、サイトへジンファミリー、BRAG/IQSECファミリー、EFA6/PSDファミリー、FBXO8(F-box only protein 8)に分類される（図）<ref name=Cox2004><pubmed>14742722</pubmed></ref><ref name=Gillingham2007><pubmed>17506703</pubmed></ref><ref name=Sztul2019><pubmed>31084567</pubmed></ref>。FBXO8以外のSec7タンパク質は、Arf各分子に対する基質親和性は異なるもののArfに対するグアニンヌクレオチド交換活性を持つ<ref name=Cox2004><pubmed>14742722</pubmed></ref><ref name=Gillingham2007><pubmed>17506703</pubmed></ref><ref name=Sztul2019><pubmed>31084567</pubmed></ref>。一方、FBXO8はSec7とともにF-boxドメインを持ち、GEFとしては機能せず、Arf6の非分解性のユビキチン化を介した活性の制御に関わる<ref name=Yano2008><pubmed>18094045</pubmed></ref>。Arf-GEFは、Sec7ドメイン以外にコイルドコイルモチーフ、プレクストリン相同(PH)ドメイン、PDZ結合モチーフ、IQモチーフなどファミリーごとに特徴的なドメイン構造を持ち、Arf-GEFの細胞内局在や活性が制御されている。例えば、BRAG1とBRAG2は、C末端のPDZ結合モチーフを介してPSD-95との結合し、海馬神経細胞の興奮性シナプスのシナプス後肥厚部に局在する<ref name=Fukaya2020><pubmed>32341099</pubmed></ref><ref name=Sakagami2008><pubmed>18164504</pubmed></ref>。また、サイトへジン-2はN末端のコイルドコイルモチーフを介してタマリンと結合し代謝型グルタミン酸受容体と複合体を形成し、興奮性シナプスのペリシナプスに局在する<ref name=Ito2021><pubmed>34390832</pubmed></ref><ref name=Kitano2002><pubmed>11850456</pubmed></ref>。一方、BRAG3はゲフィリンやジストロフィンとの結合を介して抑制性シナプスのシナプス後膜に選択的に局在する<ref name=Fukaya2011><pubmed>21198641</pubmed></ref><ref name=Um2016><pubmed>27002143</pubmed></ref>。 | Arf-GEFは、1996年に酵母からGea1が、哺乳類からサイトヘジン-2 (ARNO)とBIG１のcDNAが最初にクローニングされた<ref name=Chardin1996><pubmed>8945478</pubmed></ref><ref name=Peyroche1996><pubmed>8945477</pubmed></ref>。その一次構造の比較から、GDPからGTPへの交換活性に必須である約200アミノ酸からなるSec7ドメインの存在が明らかになった。Sec7ドメインを持つタンパク質は、ヒトでは15種存在し、ドメイン構造の特徴から、GBF1ファミリー, BIGファミリー、サイトへジンファミリー、BRAG/IQSECファミリー、EFA6/PSDファミリー、FBXO8(F-box only protein 8)に分類される（図）<ref name=Cox2004><pubmed>14742722</pubmed></ref><ref name=Gillingham2007><pubmed>17506703</pubmed></ref><ref name=Sztul2019><pubmed>31084567</pubmed></ref>。FBXO8以外のSec7タンパク質は、Arf各分子に対する基質親和性は異なるもののArfに対するグアニンヌクレオチド交換活性を持つ<ref name=Cox2004><pubmed>14742722</pubmed></ref><ref name=Gillingham2007><pubmed>17506703</pubmed></ref><ref name=Sztul2019><pubmed>31084567</pubmed></ref>。一方、FBXO8はSec7とともにF-boxドメインを持ち、GEFとしては機能せず、Arf6の非分解性のユビキチン化を介した活性の制御に関わる<ref name=Yano2008><pubmed>18094045</pubmed></ref>。Arf-GEFは、Sec7ドメイン以外にコイルドコイルモチーフ、プレクストリン相同(PH)ドメイン、PDZ結合モチーフ、IQモチーフなどファミリーごとに特徴的なドメイン構造を持ち、Arf-GEFの細胞内局在や活性が制御されている。例えば、BRAG1とBRAG2は、C末端のPDZ結合モチーフを介してPSD-95との結合し、海馬神経細胞の興奮性シナプスのシナプス後肥厚部に局在する<ref name=Fukaya2020><pubmed>32341099</pubmed></ref><ref name=Sakagami2008><pubmed>18164504</pubmed></ref>。また、サイトへジン-2はN末端のコイルドコイルモチーフを介してタマリンと結合し代謝型グルタミン酸受容体と複合体を形成し、興奮性シナプスのペリシナプスに局在する<ref name=Ito2021><pubmed>34390832</pubmed></ref><ref name=Kitano2002><pubmed>11850456</pubmed></ref>。一方、BRAG3はゲフィリンやジストロフィンとの結合を介して抑制性シナプスのシナプス後膜に選択的に局在する<ref name=Fukaya2011><pubmed>21198641</pubmed></ref><ref name=Um2016><pubmed>27002143</pubmed></ref>。 | ||
一方、精製されたArfにはGTPase活性が検出されないことより<ref name=Kahn1986><pubmed>3086320</pubmed></ref>、GAPの存在がGTPの加水分解に必須であることが発見当初より予想されていた<ref name=Kahn1986><pubmed>3086320</pubmed></ref>。1994年にRandazzoとKahnによりウシ脳抽出液にホスファチジルイノシトール 4,5-ビスリン酸 (PI(4,5)P2) 存在下で活性化するArf-GAPの存在が示された<ref name=Randazzo1994><pubmed>8144664</pubmed></ref>。同年、MaklerらによりArf1に対するGAP活性を指標に約49kDaのArf-GAPがラット肝臓より精製され<ref name=Makler1995><pubmed>7890632</pubmed></ref>。そのアミノ酸の部分配列よりcDNAが初めてクローニングされた<ref name=Cukierman1995><pubmed>8533093</pubmed></ref>。その結果、C4タイプのジンクフィンガー構造(CX2CX16CX2CX4R)からなるGAP活性に必須のArfGAPドメインが見出された。現在、ArfGAPドメインを共通に持つArf-GAP分子はヒトで31種同定されている <ref name=Kahn2008><pubmed>18809720</pubmed></ref>。ドメイン構造の類似性からArfGAP1ファミリー、ArfGAP2/3ファミリ―、SMAPファミリー、AGFGファミリー、ADAPファミリー、GITファミリー、ACAPファミリー、ASAPファミリー、AGAPファミリー、ARAPファミリーの10種類に分類される(図)<ref name=Kahn2008><pubmed>18809720</pubmed></ref>。ArfGAPのドメイン構造はArf-GEFと比べてより多彩で、例えばARAP1はArf-GAPドメインとともにRho-GAPドメインやRas結合ドメイン<ref name=Miura2002><pubmed>11804590</pubmed></ref>を、GIT1はRac-GEFであるPIXと結合するSpa2相同ドメインなどを持ち<ref name=Zhao2000><pubmed>10938112</pubmed></ref>、Arfのoffスイッチの制御分子であるとともに、Arf-GAP自体がGTP結合型Arfのエフェクターとして他のシグナル経路とのクロストークを担うものと考えられている。また、ArfGAPドメインはArf-GAP分子に必須のものではなく、ArfGAPドメインを持たないC9orf72やELMOD2がArf-GAP活性を示すことが報告されており<ref name=East2012><pubmed>23014990</pubmed></ref><ref name=Ivanova2014><pubmed>24616099</pubmed></ref><ref name=Su2021><pubmed>34145292</pubmed></ref><ref name=Su2020><pubmed>32848248</pubmed></ref>、今後さらにArf-GAPファミリーが広がる可能性がある。 | |||
また、RabやRhoファミリーと異なり、Arf活性制御にはGDP結合型の低分子量GTP結合タンパク質と結合しGDP解離を抑制するGDP解離阻害因子(GDI, GDP dissociation inhibitor)やGDP型低分子量GTP結合タンパク質からGDIを解離させるGDI置換因子(GDF, GDI displacement factor)は存在しない。 | |||
== 全身ノックアウトマウスの表現型 == | == 全身ノックアウトマウスの表現型 == | ||
これまでArf1, Arf4, Arf5, Arf6の全身型ノックアウトマウスの表現型が報告されている。 | |||
Arf1 | === Arf1 === | ||
Arf4 | 胎生致死。胎生3.5日齢 (E3.5)の胚盤胞までは野生型と外見上の差はなく成長するが、着床後まもないE5.5 においてKOマウスの71.4%に変性がみられ、E12.5にはKOマウスは消失し存在しない。胎生致死の原因は不明であるが、少なくともKOマウスの胚盤胞の栄養外胚葉や内細胞塊は野生型と同様に成長することが培養系実験で示されている<ref name=Hayakawa2014><pubmed>25305484</pubmed></ref> 。 | ||
Arf5 | |||
Arf6 | === Arf4 === | ||
胎生致死。E9.5のKOマウスは野生型と比較して著明な成長遅延を示し、E10.5には全てのKOマウスが致死に至る。KOマウスの臓性内胚葉細胞において、大型のリソソーム（頂端液胞）の減少やエンドサイトーシス受容体メガリンの頂端領域での分布の減少などが認められることより、臓性内胚葉細胞における母体―胚子間の物質交換の障害が胎生致死の機序として考えられている<ref name=Follit2014><pubmed>24586199</pubmed></ref>。 | |||
=== Arf5 === | |||
KOマウスはメンデル則に従って誕生し正常に成長する。異常な表現型は認められていない<ref name=Hosoi2019><pubmed>31201232</pubmed></ref>。 | |||
=== Arf6 === | |||
胎生致死。KOマウスは胎生中期の肝細胞索の形成障害による肝臓の発達不全を示し、胎生中期(E13.5)から後期にかけて致死に至る<ref name=Suzuki2006><pubmed>16880525</pubmed></ref>。また、E12.5のKOマウスにおいて脊髄交連神経の正中線での軸索投射異常が認められる<ref name=Kinoshita-Kawada2019><pubmed>30674481</pubmed></ref>。 | |||
== 神経系での機能 == | == 神経系での機能 == | ||
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== 神経疾患との関わり == | == 神経疾患との関わり == | ||
=== 脳形成障害 === | === 脳形成障害 === | ||
Sheenら(2004)は、小脳症と脳室周囲異所性灰白質を持つトルコ家系からクラスI Arfに対するGEFであるBIG2/ARFGEF2のホモ接合型ミスセンス変異を同定した<ref name=Sheen2004><pubmed>14647276</pubmed></ref>。さらにゲノムの翻訳部領域においてミスセンス変異が生じることが通常ないゲノム領域(missense-depleted region)に着目した、先天性脳構造異常の患者に対するエクソーム解析により、MRIで脳室周囲結節性異所性灰白質を示す発達障害とともに注意欠損多動性障害を示す男児からARF1のGDP結合部位のミスセンス変異(p.Tyr35His)が同定された<ref name=Ge2016><pubmed>28868155</pubmed></ref>。その後、ARF１遺伝子のde novoミスセンス変異がさらに13ヶ所見出されている<ref name= | Sheenら(2004)は、小脳症と脳室周囲異所性灰白質を持つトルコ家系からクラスI Arfに対するGEFであるBIG2/ARFGEF2のホモ接合型ミスセンス変異を同定した<ref name=Sheen2004><pubmed>14647276</pubmed></ref>。さらにゲノムの翻訳部領域においてミスセンス変異が生じることが通常ないゲノム領域(missense-depleted region)に着目した、先天性脳構造異常の患者に対するエクソーム解析により、MRIで脳室周囲結節性異所性灰白質を示す発達障害とともに注意欠損多動性障害を示す男児からARF1のGDP結合部位のミスセンス変異(p.Tyr35His)が同定された<ref name=Ge2016><pubmed>28868155</pubmed></ref>。その後、ARF１遺伝子のde novoミスセンス変異がさらに13ヶ所見出されている<ref name=deSainteAgathe2023><pubmed>37185208</pubmed></ref><ref name=Ishida2023><pubmed>36345169</pubmed></ref>。ARF1遺伝子変異を持つ患者は、知的障害とともに小脳症、異所性灰白質、脳梁の菲薄化などの種々の程度の脳構造異常を伴う。小脳症と脳室周囲異所性灰白質の機序として、BIG2→ARF1経路の障害による脳室上皮細胞間の細胞接着を介した脳室帯構造維持の破綻や神経幹細胞の細胞増殖の障害とともに脳室帯離脱後の細胞移動障害などが考えられている。 | ||
また、常染色体顕性遺伝性の先天性脳形成異常の患者からARF3遺伝子の２種類のde novoのミスセンス変異が同定されている<ref name=Sakamoto2021><pubmed>34346499</pubmed></ref>。ARF3遺伝子変異患者が呈した脳形成障害は、進行性の大脳や脳幹の萎縮あるいは非進行性の小脳低形成で2症例間で異なるが、いずれの患者も著明な発育遅延、てんかん、知的障害を伴う。 | また、常染色体顕性遺伝性の先天性脳形成異常の患者からARF3遺伝子の２種類のde novoのミスセンス変異が同定されている<ref name=Sakamoto2021><pubmed>34346499</pubmed></ref>。ARF3遺伝子変異患者が呈した脳形成障害は、進行性の大脳や脳幹の萎縮あるいは非進行性の小脳低形成で2症例間で異なるが、いずれの患者も著明な発育遅延、てんかん、知的障害を伴う。 | ||