「高速液体クロマトグラフィー」の版間の差分

　HPLCで目的の物質がそのまま分析できない場合、感度を上げるために誘導化を行うことが多い。その誘導化の方法には、プレカラム法（図１-B）と ポストカラム法（図１-C）がある。

　図２-AのHPLCシステムではアイソクラティック法にスイッチングバルブ装置を組んでいる（構成：移動相２液、ポンプ２台、スイッチングバルブ１台、トラップカラム１本、分離用カラム２本、検出器２台）。スイッチングバルブとは、特定な時間を設定してその時間になると流路を切り替えることができる装置のことである。トラップカラムは、サンプル内の物質を一時的に保持するための長さが短いカラム（１cm程度）である。インジェクション前の流路は、移動相AはポンプA ⇨ インジェクター ⇨ トラップカラム ⇨ カラムA ⇨ 検出器Aへ流れている。このとき移動相Bは、ポンプB ⇨ カラムB ⇨ 検出器Bを流れており、トラップカラムには流れない。インジェクション後スイッチングバルブ設定時間にバルブが作動するとトラップカラムに移動相Bが流れる。このシステムで重要な点は、スイッチングバルブ設定時間である。設定時間を調節することによりカラムBで検出する物質の溶出時間を変えることができる。また目的物質の溶出が移動相の変わり目になると正確な分析ができなくなるため注意が必要である。溶出時間の速いものと遅いものを同時に分析したい場合、スイッチングバルブ法は１本のカラムで分析する場合と比較し約半分の時間でかつ溶出時間の遅い物質を感度良く分析できる利点がある。

　OPA法は、オルトフタルアルデヒド（o-Phthalaldehyde, OPA）、メルカプトエタノール、アミノ酸由来のアミノ基が環化反応し蛍光を発する物質になり、分析を可能にする方法である(図２-A)。OPA誘導体は、励起波長350±10 nm，蛍光波長450±10 nm程度で蛍光検出することができる。

　図２-Bに示したHPLCの構成で、グラジエント法を用いて分析した。移動相は２種類あり、移動相Aの組成は、100 mM リン酸緩衝液（pH 5.6）、移動相Bの組成は100％アセトニトリルでステップワイズに濃度を変え、25分間で1分析を行った（グラジエントの条件：0 min→1 min 15%, 1 min→4.5 min 16%,  4.5 min→8 min 21%, 8 min→11 min 24%, 11 min→13.5 min 31%, 13.5 min→16.5 min 35%, 16.5 min→25 min 15%）。

　試料の前処理として、摘出した脳組織にすみやかに5〜10倍量の0.2 M PCA(100 μM EDTA･2Na含有)を加え、超音波で30秒間ホモジナイズした。次に、除タンパクを完全にするため氷中で30分間放置した後、４℃で10,000 rpm × 15分間遠心し、上清を採取した。上清は20倍に希釈し、15 μLを HPLCサンプルとした。サンプルは、オートサンプラー内にてOPA試薬と反応し、HPLCで分析した。すなわち蛍光誘導化のため反応型のオートサンプラーのサンプルラックを12℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μL、100 mM ホウ酸緩衝液（pH 10.0）20 μLを加え30℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル35μLをHPLCにインジェクションした。

　蛍光誘導化のため、オートサンプラーのサンプルラックを12℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μLを加え30℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル10 μLをインジェクションした。