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英：High Performance Liquid Chromatography、英略語：HPLC | 英：High Performance Liquid Chromatography、英略語：HPLC | ||
高速液体クロマトグラフィーとは、物質が固定相（カラムの担体）とこれに接して流れる移動相（液体）との親和力の違いから一定の比率で分布し、その比率が物質によって異なる事を利用して分離する方法である。移動相を高圧で流すことで高い分離および感度を得ることができ、固定相、移動相、検出器の組み合わせにより様々な物質の分析を行うことが可能である。脳科学分野においても各種[[神経伝達物質]]やタンパク質、ペプチドの分析など、幅広く利用されている。 | |||
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#カラム | #カラム | ||
#: カラムは、分析する物質の性質を考慮して種類を選択しなければならない。カラムの種類には、主にイオン交換、逆相、順相、サイズ排除（ゲル濾過）そして光学異性体分離カラムがある。イオン交換カラムには、陽イオン、陰イオン、両イオン型の３つのタイプがある。これらは、金属イオン、無機酸、アミノ酸、ペプチドやタンパク質の分析・分取に用いられる。逆相カラムは、最も種類が多く様々なカラムが開発されている。特に低分子の分析に用いられることが多く神経伝達物質、誘導化したアミノ酸、医薬品、ホルモン、ペプチドの分析などに用いられている。順相カラムは、有機合成した化合物の分離に多く用いられる。サイズ排除カラムは、タンパク質を分子量ごとに分画または会合体としてモノマー、ダイマー、トリマーの分析・分取に用いられる。光学異性体分離カラムはアミノ酸のD体とL体や医薬品などの光学異性体化合物の分析・分取に用いられている。 | #: カラムは、分析する物質の性質を考慮して種類を選択しなければならない。カラムの種類には、主にイオン交換、逆相、順相、サイズ排除（ゲル濾過）そして光学異性体分離カラムがある。イオン交換カラムには、陽イオン、陰イオン、両イオン型の３つのタイプがある。これらは、金属イオン、無機酸、アミノ酸、ペプチドやタンパク質の分析・分取に用いられる。逆相カラムは、最も種類が多く様々なカラムが開発されている。特に低分子の分析に用いられることが多く神経伝達物質、誘導化したアミノ酸、医薬品、ホルモン、ペプチドの分析などに用いられている。順相カラムは、有機合成した化合物の分離に多く用いられる。サイズ排除カラムは、タンパク質を分子量ごとに分画または会合体としてモノマー、ダイマー、トリマーの分析・分取に用いられる。光学異性体分離カラムはアミノ酸のD体とL体や医薬品などの光学異性体化合物の分析・分取に用いられている。 | ||
[[ファイル:HPLC 図2.jpg|thumb|300px|right|図2. (A) OPA化のアミノ基の反応． (B) 実験に用いたHPLCのフローチャート. (C)と(D)は、 OPA化アミノ酸のクロマトグラム. (C) 0.5~ | [[ファイル:HPLC 図2.jpg|thumb|300px|right|図2. (A) OPA化のアミノ基の反応． (B) 実験に用いたHPLCのフローチャート. (C)と(D)は、 OPA化アミノ酸のクロマトグラム. (C) 0.5~20 pmol/uLのスタンダード. (D)脳組織をホモジネートしたサンプル.。<br />[分析条件] 装置：Shimadzu SCL-10Avpシステム, オートサンプラー：GILSON 232XLシステム，カラム：COSMOSIL 5C18-MS-II(4.6ID×150 mm)， 流速：0.8 ml/min， カラム温度：36 ℃， 励起波長：340 nm, 蛍光波長：445 nm．]] | ||
#検出器 | #検出器 | ||
#: 様々な検出器が開発されておりUV検出器、蛍光検出器、電気化学検出器、質量分析器、蒸発光散乱検出器などが用いられている。HPLCにおいて、最も汎用的な検出器はUV 検出器であり、次いで蛍光検出器、電気化学検出器の順である。 | #: 様々な検出器が開発されておりUV検出器、蛍光検出器、電気化学検出器、質量分析器、蒸発光散乱検出器などが用いられている。HPLCにおいて、最も汎用的な検出器はUV 検出器であり、次いで蛍光検出器、電気化学検出器の順である。 | ||
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===応用例（スイッチングバルブ法）=== | ===応用例（スイッチングバルブ法）=== | ||
 これまでHPLCの一般的な装置構成について述べてきた。ここでは、装置構成の応用例としてスイッチングバルブ装置を用いたHPLCのシステムについて述べる。 |  これまでHPLCの一般的な装置構成について述べてきた。ここでは、装置構成の応用例としてスイッチングバルブ装置を用いたHPLCのシステムについて述べる。 | ||
[[ファイル:HPLC 図3.jpg|thumb|300px|right|図 3. (A) HPLCのフローチャート, (B) 2pmol/μLのスタンダード, (C) 脳組織ホモジネートのサンプル.<br />[分析条件] 装置：ポンプHITACHI L-2130，検出器：EICOM L7480とGL Sciences GL-7453A，カラムオーブン：EICOM CTC-100，デガッサー：EICOM DG-100，オートサンプラー：EICOM，ソフトウェア：PowerChrom EPC-500，トラップカラム：COSMOSIL Guard 5C18-MS-II(4. | [[ファイル:HPLC 図3.jpg|thumb|300px|right|図 3. (A) HPLCのフローチャート, (B) 2pmol/μLのスタンダード, (C) 脳組織ホモジネートのサンプル.<br />[分析条件] 装置：ポンプHITACHI L-2130，検出器：EICOM L7480とGL Sciences GL-7453A，カラムオーブン：EICOM CTC-100，デガッサー：EICOM DG-100，オートサンプラー：EICOM，ソフトウェア：PowerChrom EPC-500，トラップカラム：COSMOSIL Guard 5C18-MS-II(4.6ID×10 mm), 分離用カラム：COSMOSIL 5C18-MS-II(4.6ID×150 mm), 流速：1.1 ml/min, カラム温度：36 ℃, 励起波長：340 nm, 蛍光波長：440 nm． | ||
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<br /> | <br />図3-AのHPLCシステムではアイソクラティック法にスイッチングバルブ装置を組んでいる（構成：移動相２液、ポンプ２台、スイッチングバルブ１台、トラップカラム１本、分離用カラム２本、検出器２台）。スイッチングバルブとは、特定な時間を設定してその時間になると流路を切り替えることができる装置のことである。トラップカラムは、サンプル内の物質を一時的に保持するための長さが短いカラム（1 cm程度）である。インジェクション前の流路は、移動相AはポンプA → インジェクター → トラップカラム → カラムA → 検出器Aへ流れている。このとき移動相Bは、ポンプB → カラムB → 検出器Bを流れており、トラップカラムには流れない。インジェクション後スイッチングバルブ設定時間にバルブが作動するとトラップカラムに移動相Bが流れる。このシステムで重要な点は、スイッチングバルブ設定時間である。設定時間を調節することによりカラムBで検出する物質の溶出時間を変えることができる。また目的物質の溶出が移動相の変わり目になると正確な分析ができなくなるため注意が必要である。溶出時間の速いものと遅いものを同時に分析したい場合、スイッチングバルブ法は１本のカラムで分析する場合と比較し約半分の時間でかつ溶出時間の遅い物質を感度良く分析できる利点がある。 | ||
==脳科学への応用== | ==脳科学への応用== | ||