「高速液体クロマトグラフィー」の版間の差分

#測定例２　（スイッチングバルブ法）

#:&ensp;図3-Aに示したHPLCの構成で、アイソクラティック法を用いて脳組織のホモジネートを分析した。<br />移動相は２種類あり、移動相Aにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 5.8, 12%アセトニトリル、移動相Bにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 6.2, 25%アセトニトリルを用い15分間で1分析を行った。スイッチングバルブは、インジェクションから1分30秒で切り替わり、12分後に元の流路に戻るセッティングをした。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬5 mgをメタノール200 μLで溶解した後、2メルカプトエタノール5 μL、0.1 M　Na₂CO₃溶液800 μL加え、調製した。試料の前処理は、測定例（1）と同様に行い、上清を1200倍に希釈して15 μLをHPLCサンプルにした。蛍光誘導化のため、オートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル10 μLをインジェクションした。

[[ファイル:HPLC 図4.jpg|thumb|300px|right|図 4. (A) ドーパミンの酸化反応. (B) 標準物質の分析; 10-100 pg の範囲で定量性がある。(C) マウス線条体抽出物の分析; ドーパミン作動性ニューロンが多いことが分かる。(D) マウス小脳抽出物の分析; 線条体と全く異なる溶出パターンをすることが分かる。<br />[分析条件] 装置:エイコム社製システム（デガッサー：DG-300, ポンプ：EP-300, カラムオーブン：ATC-300, 検出器：ECD-300, EICOM), カラム : EICOMPAK SC-50DS (3.0ID &times; 150 mm, EICOM), 移動相: 83% 0.1 M 酢酸-クエン酸緩衝液(pH 3.5)/17% メタノール(190 mg/L SOS, 5 mg/L EDTA•2Na を含む), 流速:0.5 mL/min, 作用電極: グラファイト電極(WE-3G, EICOM), 印加電圧:+750 mV vs. Ag/AgCl(RE-100, EICOM), 注入量:10 μL, 温度: 25℃,<br />

MHPG:3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol,　NA:Noradrenaline,　AD:Adrenaline,　DOPAC:3,4-dihydroxy-phenylacetic acid, NM:Normethanephrine, DA:Dopamine, 5-HIAA:5-Hydroxyindoleacetic acid, ISO:Isoproterenol, HVA:Homovanillic acid, 3-MT:3-Methoxytyramine, 5-HT:5-Hydroxytryptamine

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#電気化学検出の原理

#:&ensp;酸化還元活性を有する物質を高感度に検出する方法である。一定の電位を印加した電極上で物質が酸化又は還元された時に流れる電流を検出する。電流量は濃度に比例する為、定量分析が可能である。検出器には、電流測定検出器 (Amperometric detector) と電量検出器(Coulometric detector) の2種類があり、一般的にHPLCにおいては電流測定検出器を用いることが多い。これは、電量検出器に比べて電解効率が大幅に低いものの、良いシグナルノイズ比・感度が得られるためである。検出セルは作用電極、参照電極、対極電極からなり、作用電極は測定対象に応じてグラッシーカーボン、グラファイト、白金などを使用する。電気化学検出は1950年代にKemuraによって最初にクロマトグラフィーの検出法として用いられ、1960年代後半から1970年代前半にかけてAdamsらにより[[カテコールアミン]]およびアスコルビン酸の分析に応用された。それからさらなる改良が重ねられ、現在神経伝達物質およびその代謝物の定量方法として、一般的な技術となっている。詳細な測定原理や方法については、Meffordによる総説<ref name=ref2><pubmed>6163932</pubmed></ref>やZapataらのプロトコル<ref name=ref3><pubmed>19575473</pubmed></ref>等が参考となる。