9,444
回編集
「サザンブロット」の版間の差分
ナビゲーションに移動
検索に移動
細
編集の要約なし
細編集の要約なし |
|||
| 1行目: | 1行目: | ||
[[Image:サザンブロット図1.jpg|thumb|right| | [[Image:サザンブロット図1.jpg|thumb|right|300px|'''図１．相補性のある2本のDNA鎖は一対の2本鎖を形成する。''']] | ||
英語名：Southern blot | 英語名：Southern blot | ||
[[wikipedia:ja:|相補性]]のある2本の[[wikipedia:ja:|DNA1]]本鎖は一対の2本鎖を形成するというDNAの性質（図１）を利用して、ある特定の[[wikipedia:ja:|塩基配列]]をもつDNA断片を検出する方法である。E. M. Southernが考案した<ref><pubmed> 1195397 </pubmed></ref>ためにこの名が付けられた。 | |||
== 手順 == | == 手順 == | ||
[[Image:サザンブロット図2.jpg|thumb|right| | [[Image:サザンブロット図2.jpg|thumb|right|300px|'''図２．サザンブロットの手順''']] | ||
本法の手順を図２に示す。 | 本法の手順を図２に示す。 | ||
#制限酵素によるDNAの消化 | #制限酵素によるDNAの消化 この際にメチル化感受性制限酵素と非[[wikipedia:ja:|メチル化]]感受性[[wikipedia:ja:|制限酵素]]を組み合わせて使用することで後述に示すDNAメチル化状態の解析が出来る。 | ||
# | #[[wikipedia:ja:|アガロースゲル]][[wikipedia:ja:|電気泳動]] | ||
#ゲル内DNAの変性 電気泳動により分離されたDNAをアガロースゲル内で1本鎖にする（変性）ために電気泳動後のアガロースゲルをNaOHなどの塩基性溶液で処理をする。 | #ゲル内DNAの変性 電気泳動により分離されたDNAをアガロースゲル内で1本鎖にする（変性）ために電気泳動後のアガロースゲルをNaOHなどの塩基性溶液で処理をする。 | ||
#メンブランへの転写 | #メンブランへの転写 アガロースゲル内のDNAを泳動パターンを維持したままを[[wikipedia:ja:|毛細管現象]]を利用してナイロン製やニトロセルロース製のメンブランへ転写する。この作業には数時間から一晩要するため、近年は電気的に転写するエレクトロブロット、吸引によるバキュームブロットなど短時間で転写できる装置も市販されている。 | ||
#プローブとの反応 | #プローブとの反応 特定の塩基配列を検出するための標識（ラベリング）された[[wikipedia:ja:|核酸]]をプローブと呼び、標識には放射性同位体の他、アルカリフォスファターゼなどの酵素が利用される。プローブに用いる核酸はDNA, RNAいずれも使用でき、それぞれDNAプローブ、RNAプローブと呼ばれる。RNAプローブはDNAプローブに比してメンブラン上のDNAとの結合力が高いが扱いにくいためDNAプローブが頻用される。ただしDNAプローブは使用前に1本鎖にする必要がある。 これらのプローブをDNAを転写したメンブラン上で反応させることで相補的な配列をもつDNAとプローブが2本鎖を形成する。 なお、このときに塩濃度を高くすることでプローブの配列と一致しないまでも相同性の高い配列を持つDNAは2本鎖を形成する。これを利用すれば異なる動物種間の遺伝子、あるいは相同遺伝子を検出することが出来る場合もある。 | ||
#メンブランの洗浄 メンブラン上のDNAに結合しなかったプローブを洗浄する。この際にも洗浄液の塩濃度を高くすることでプローブと多少配列が異なるDNA間の2本鎖は結合したままにすることが出来る。 | #メンブランの洗浄 メンブラン上のDNAに結合しなかったプローブを洗浄する。この際にも洗浄液の塩濃度を高くすることでプローブと多少配列が異なるDNA間の2本鎖は結合したままにすることが出来る。 | ||
#検出 プローブ標識に放射性同位体を用いた場合はX線フィルムをを用いたオートラジオグラフィーでプローブの位置を検出する。また、プローブをアルカリホスファターゼ標識した場合は発光基質を反応させその発光をフィルムで検出するほか、CCDカメラなどの検出器なども用いられる。 | #検出 プローブ標識に放射性同位体を用いた場合はX線フィルムをを用いたオートラジオグラフィーでプローブの位置を検出する。また、プローブをアルカリホスファターゼ標識した場合は発光基質を反応させその発光をフィルムで検出するほか、CCDカメラなどの検出器なども用いられる。 | ||
| 25行目: | 25行目: | ||
== 使用例 == | == 使用例 == | ||
[[Image:サザンブロット図3.jpg|thumb|right| | [[Image:サザンブロット図3.jpg|thumb|right|300px|'''図３．サザンブロットにより遺伝子変異の検出例''']] | ||
[[Image:サザンブロット図4.jpg|thumb|right| | [[Image:サザンブロット図4.jpg|thumb|right|300px|'''図４．サザンブロットによるDNAメチル化状態の解析例''']] | ||
=== 遺伝子変異の検出 === | === 遺伝子変異の検出 === | ||