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====酵素抗体法と蛍光抗体法==== | ====酵素抗体法と蛍光抗体法==== | ||
[[image:In situハイブリダイゼーション法3.png|thumb|300px|'''図3．アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。<ref>[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 | [[image:In situハイブリダイゼーション法3.png|thumb|300px|'''図3．アルカリフォスファッターゼによる発色反応'''<br>BCIPがAPにより加水分解されてまず中間産物となり、さらに2量体になって青色色素を産生する。2量体化するときに、2個の水素イオンによりNBTは還元されて不溶性のNBTホルマザンを形成する。(tautomerism:ケト・エノール互変異性)<br>一方、Fast Red TRは、ナフトールAS-MXリン酸の存在下でAPにより赤色の沈殿物を生じる。Fast Red TRを蛍光性のAP基質であるHNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate)と共に用いると、還元されてできるHNPの組織への沈着が増し、HNPの蛍光がさらに長波長側シフトして (565~620nm) 強い橙蛍光を発する。<ref>[http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=5A423056-5056-8A76-4E25-1E5F9C0596B2 発色反応、発色基質全般]</ref>]] | ||
標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、アルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase: AP）またはホースラディシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、BCIP (X-リン酸と呼ぶ)（5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt）およびNBT(nitro-blue tetrazolium chloride)を用いた場合は、酵素がXの結合を切断し、Xが遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査顕微鏡で検出する。 | 標識プローブのみでは発色することができないので、プローブの中に取り込まれている抗原に対する抗体を用いプローブの検出を行う．プローブをDIGで標識した場合、DIGに特異的に結合する一次抗体を用いて検出する。検出に用いる一次抗体には通常の抗体とは異なり、アルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase: AP）またはホースラディシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase: HRP）などの酵素が結合（conjugate）している．例えば、抗体に結合されたAPの基質として、BCIP (X-リン酸と呼ぶ)（5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolylphosphate p-Toluidine salt）およびNBT(nitro-blue tetrazolium chloride)を用いた場合は、酵素がXの結合を切断し、Xが遊離すると発色する（図3）。一方、抗体に蛍光色素が結合している場合には、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー走査顕微鏡で検出する。 | ||
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#Choi HM, Chang JY, Trinh le A, Padilla JE, Fraser SE, Pierce NA. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 2010 Nov;28(11):1208-1212. | #Choi HM, Chang JY, Trinh le A, Padilla JE, Fraser SE, Pierce NA. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 2010 Nov;28(11):1208-1212. | ||
#アレン ブレイン アトラス<br>Lein ES et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 2007 Jan 11;445(7124):168-176. | #アレン ブレイン アトラス<br>Lein ES et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 2007 Jan 11;445(7124):168-176. | ||
<references /> | <references /> | ||
（執筆者：大内淑代 担当編集委員：大隅典子） | （執筆者：大内淑代 担当編集委員：大隅典子） | ||