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遺伝子から転写されたmRNAの量は、遺伝子機能の量的な面を反映していると考えられるため、遺伝子の発現量から機能を推測しようというのが、この遺伝子発現解析の基本的な概念である。本技法は、1992年にLiangとPardeeにより、mRNAレベルで[[wikipedia:ja:真核生物|真核細胞]]の試料間で、遺伝子発現の同定比較を行うことできる技術として発表された<ref name="Liang_Pardee_Science" /><ref name="Liang_Biotech" />。形態的、遺伝学的、または実験的処置等に異なる試料間で、どの遺伝子発現に変化・差異があるかを見出すことができる。 | 遺伝子から転写されたmRNAの量は、遺伝子機能の量的な面を反映していると考えられるため、遺伝子の発現量から機能を推測しようというのが、この遺伝子発現解析の基本的な概念である。本技法は、1992年にLiangとPardeeにより、mRNAレベルで[[wikipedia:ja:真核生物|真核細胞]]の試料間で、遺伝子発現の同定比較を行うことできる技術として発表された<ref name="Liang_Pardee_Science" /><ref name="Liang_Biotech" />。形態的、遺伝学的、または実験的処置等に異なる試料間で、どの遺伝子発現に変化・差異があるかを見出すことができる。 | ||
例えば、物質Aの添加により遺伝子Bの発現の増加/減少が見出された場合、この遺伝子Bの発現が物質Aにより誘導/抑制されていると考えられる。防御蛋白質や阻害作用の解析などに多くの適用が考えられる。脳神経科学領域では、ある[[学習]]課題が成立した動物個体としていない動物個体の細胞間で、発現に差のある遺伝子を同定することで、その学習に関与する遺伝子群が同定された適応例がある(図1)<ref><pubmed>10531455</pubmed></ref><ref><pubmed>11168596</pubmed></ref> | 例えば、物質Aの添加により遺伝子Bの発現の増加/減少が見出された場合、この遺伝子Bの発現が物質Aにより誘導/抑制されていると考えられる。防御蛋白質や阻害作用の解析などに多くの適用が考えられる。脳神経科学領域では、ある[[学習]]課題が成立した動物個体としていない動物個体の細胞間で、発現に差のある遺伝子を同定することで、その学習に関与する遺伝子群が同定された適応例がある(図1)<ref><pubmed>10531455</pubmed></ref><ref><pubmed>11168596</pubmed></ref>。[[Image:DD-fig1rev.jpg|thumb|center|300px|図1 Differential Displayの結果。 条件付けを行った軟体動物（ナメクジ）個体(P, Paired)及び対照群の個体(U, Unpaired)、各群2サンプルから調整したtotal RNAを用いてDDを行った。 用いたOligodTMN primer (N = C)及びArbitrary primerは上部に示す。本実験はGeneHunter社の製品を用いて行った。群間で差があり、且つ2サンプルで再現性のあるバンドを探索した。多くのバンドが再現性良く現れており、群間で差は認められない。*で示すバンドは同一群内で異なる結果を示していることから、本実験では再現性が無い、と判断できた。矢印で示す1及び2がPaired群で増加、3及び4が減少しているバンドを示す。右パネルはDNAマーカーを示す。]]比較的感度が良く、実験操作も簡便に行うことができ、また必要に応じて、3試料以上の間での比較に拡張することも可能である。 | ||
原法では、検出方法として[[wikipedia:ja:放射性同位元素|放射性同位元素]]（radioisotope, RI）を用いていた(RI-DD法)が<ref name="Liang_Pardee_Science" />、その後、蛍光標識された[[wikipedia:ja:プライマー (生物)|プライマー]]を用いて検出する「[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]ディファレンシャルディスプレイ (FDD) 法」が開発され、検出感度、操作性や再現性が高められた<ref name="Liang_Biotech" /><ref>'''伊藤隆司'''&amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;gt;Differential Display&amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;gt;実験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック改訂第4版（村松正實、 山本雅編）羊土社: 2003, pp. 60-64 （なお、第5版から本項目は削除されている）</ref>。 | 原法では、検出方法として[[wikipedia:ja:放射性同位元素|放射性同位元素]]（radioisotope, RI）を用いていた(RI-DD法)が<ref name="Liang_Pardee_Science" />、その後、蛍光標識された[[wikipedia:ja:プライマー (生物)|プライマー]]を用いて検出する「[[wikipedia:ja:蛍光|蛍光]]ディファレンシャルディスプレイ (FDD) 法」が開発され、検出感度、操作性や再現性が高められた<ref name="Liang_Biotech" /><ref>'''伊藤隆司'''&amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;gt;Differential Display&amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;lt;br&amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;amp;gt;実験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック改訂第4版（村松正實、 山本雅編）羊土社: 2003, pp. 60-64 （なお、第5版から本項目は削除されている）</ref>。 | ||
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== 方法と手順 == | == 方法と手順 == | ||
以下、通常のmRNA試料を対象としたディファレンシャルディスプレイ法について説明する (図2)。 | 以下、通常のmRNA試料を対象としたディファレンシャルディスプレイ法について説明する (図2)。[[Image:DDRT-fig3.jpg|thumb|center|300px|図2 ディファレンシャルディスプレイ法の手順]] | ||
細胞中で発現したmRNAすべてを[[wikipedia:ja:逆転写|逆転写]]しcDNAを得た後、これを鋳型にして複数の混合プライマーを用いたPCRを行う。ここで、特異性を持たせずできるだけ多くの種類のcDNA断片を増幅するよう設定した複数のプライマーを用いることにより、非常に多数のバンドが得られる。１つの細胞で発現し得る約15,000種類の遺伝子すべての発現を網羅して探索するために、3種類のアンカープライマーと20種類の混成プライマー(10 mer)を用いてPCRを行う。得られたバンドの強弱を遺伝子発現の強度の指標とし、特定の物質添加の有無などさまざまな操作・環境の違いによりその細胞のどの遺伝子が変化しているかを見出す。 | 細胞中で発現したmRNAすべてを[[wikipedia:ja:逆転写|逆転写]]しcDNAを得た後、これを鋳型にして複数の混合プライマーを用いたPCRを行う。ここで、特異性を持たせずできるだけ多くの種類のcDNA断片を増幅するよう設定した複数のプライマーを用いることにより、非常に多数のバンドが得られる。１つの細胞で発現し得る約15,000種類の遺伝子すべての発現を網羅して探索するために、3種類のアンカープライマーと20種類の混成プライマー(10 mer)を用いてPCRを行う。得られたバンドの強弱を遺伝子発現の強度の指標とし、特定の物質添加の有無などさまざまな操作・環境の違いによりその細胞のどの遺伝子が変化しているかを見出す。 | ||