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また同年、活性化型Srcによってチロシンリン酸化を受ける可能性のある５つのチロシンが同定され、この５つのチロシンリン酸化部位全てをフェニルアラニンに変異させたノックインマウスが、リーラーフェノタイプになる事が示された。この実験結果により、Dab1のチロシンリン酸化はReelinシグナルにとって必須であることが示された。 | また同年、活性化型Srcによってチロシンリン酸化を受ける可能性のある５つのチロシンが同定され、この５つのチロシンリン酸化部位全てをフェニルアラニンに変異させたノックインマウスが、リーラーフェノタイプになる事が示された。この実験結果により、Dab1のチロシンリン酸化はReelinシグナルにとって必須であることが示された。 | ||
2003年以降、チロシンリン酸化されたDab1に結合する様々なタンパク質が報告され、現在までにPI3K、SOCS3、Nckbeta、Lis1、SFKs、Crkファミリータンパク質（Crk、CrkL）がDab1のチロシンリン酸化依存的に結合することが報告されている。このうちCrkとCrkLダブルノックアウトマウス、C3Gのジーントラップ系統マウス、及びSrcとFynのダブルノックアウトマウスにおいてリーラフェノタイプが報告されている。また、Dab1のチロシンリン酸化とは関係なく、あるいは関係がわかっていなく、Dab1に結合する分子として、Notch、Dab2IP、mPcdh18、APP、APLP1、 APLP2、N-WASPが知られている。 | |||
2004年には、dab1欠損マウスの海馬歯状回の顆粒細胞の樹状突起が野生型に比べて突起の数が減少していること、dab1欠損マウス由来の培養海馬神経細胞の樹状突起が短くなり、枝分かれの数も減少することが報告された。また、2006年、Dab1のノックダウン実験により、神経細胞の樹状突起形成が阻害されること、生後三日目からdab1を時期特異的にノックアウトした場合、海馬の樹状突起形成が阻害されることが、報告され、dab1は神経細胞の移動過程以外にも、神経細胞の樹状突起の発達にも関与することが示唆された。 | 2004年には、dab1欠損マウスの海馬歯状回の顆粒細胞の樹状突起が野生型に比べて突起の数が減少していること、dab1欠損マウス由来の培養海馬神経細胞の樹状突起が短くなり、枝分かれの数も減少することが報告された。また、2006年、Dab1のノックダウン実験により、神経細胞の樹状突起形成が阻害されること、生後三日目からdab1を時期特異的にノックアウトした場合、海馬の樹状突起形成が阻害されることが、報告され、dab1は神経細胞の移動過程以外にも、神経細胞の樹状突起の発達にも関与することが示唆された。 | ||
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マウスではオルタナティブスプライシングにより１３種のバリアントが存在することが報告されているが、発達過程の中枢神経系では555アミノ酸を持つバリアント、Dab1 p80が最も多く発現している。Dab1 (Dab1 555)はN末端側からPhosphotyrosine-binding (PTB) domain、チロシンリン酸化部位を持つ細胞内タンパク質である。PTBドメインは、細胞内ドメインにNPxYモチーフを持つ膜タンパク質と結合する。この結合にはNPxYモチーフのチロシン残基のリン酸化は必要としない。PTBドメインにはplekstrin homology (PH)ドメイン様構造が含まれており、リン脂質（PtdIns4P and PtdIns4,5P2）に結合することが出来る。また、PTBドメインのN末端側には核移行シグナル(Nuclear localization Signal: NLS)、PTBドメインのC末端側に二つの核外移行シグナル(Nuclear Export Signal: NES)を持っており、核と細胞質間を移行する能力を有している。PTBドメインのC末端側、分子の中程にチロシンリン酸化を受ける部位が５カ所（Y185、Y198、Y200、Y220、Y232）同定されており、このうちの４つがシグナルの伝達に重要な役割を果たしている事が明らかにされている。４つのチロシンリン酸化サイトは配列の相同性からYQXI配列を持つ２つ(Y185、Y198）とYXVP配列を持つ二つ（Y220、Y232）に分けられる。 興奮性神経細胞の移動に関しては、YQXI配列を持つY185とY198の間、およびYXVP配列を持つY220とY232の間で冗長性を持つが、YQXIとYXVP配列の間では冗長性を持たない。 | マウスではオルタナティブスプライシングにより１３種のバリアントが存在することが報告されているが、発達過程の中枢神経系では555アミノ酸を持つバリアント、Dab1 p80が最も多く発現している。Dab1 (Dab1 555)はN末端側からPhosphotyrosine-binding (PTB) domain、チロシンリン酸化部位を持つ細胞内タンパク質である。PTBドメインは、細胞内ドメインにNPxYモチーフを持つ膜タンパク質と結合する。この結合にはNPxYモチーフのチロシン残基のリン酸化は必要としない。PTBドメインにはplekstrin homology (PH)ドメイン様構造が含まれており、リン脂質（PtdIns4P and PtdIns4,5P2）に結合することが出来る。また、PTBドメインのN末端側には核移行シグナル(Nuclear localization Signal: NLS)、PTBドメインのC末端側に二つの核外移行シグナル(Nuclear Export Signal: NES)を持っており、核と細胞質間を移行する能力を有している。PTBドメインのC末端側、分子の中程にチロシンリン酸化を受ける部位が５カ所（Y185、Y198、Y200、Y220、Y232）同定されており、このうちの４つがシグナルの伝達に重要な役割を果たしている事が明らかにされている。４つのチロシンリン酸化サイトは配列の相同性からYQXI配列を持つ２つ(Y185、Y198）とYXVP配列を持つ二つ（Y220、Y232）に分けられる。 興奮性神経細胞の移動に関しては、YQXI配列を持つY185とY198の間、およびYXVP配列を持つY220とY232の間で冗長性を持つが、YQXIとYXVP配列の間では冗長性を持たない。 | ||
ユビキチン化により、分解される。 | ユビキチン化により、分解される。 | ||
== サブファミリー == | == サブファミリー == | ||
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ほ乳類ではDab2が存在しており、細胞表面分子のターンオーバー、エンドサイトーシス等に関与していることが知られている。 | ほ乳類ではDab2が存在しており、細胞表面分子のターンオーバー、エンドサイトーシス等に関与していることが知られている。 | ||
== | == 発現様式 == | ||
in situ hybridizationにより、dab1 mRNAの発現分布を調べた報告によると、発生期のマウス大脳新皮質では、胎生11.5日目の神経上皮細胞に弱く発現が観察される。胎生12.5日目には皮質板での強い発現が顕著になり、VZでの弱い発現も引き続き観察される。その後、P0にかけて、強い皮質板での発現が維持されるが、VZでの発現は弱くなり、IMZの上部での弱い発現が観察されるようになる。アダルトのマウスでもP0に比べて弱くはなるが、CPにおいて発現が観察される。Dab1の発現部位は、Reelinを発現しているCajal-Retzius細胞が存在する辺縁帯と相互排他的発現パターンになっている。海馬では妊娠12.5日目には神経上皮細胞に弱くdab1のmRNAが観察され、妊娠14.5日目までに海馬の辺縁帯、錐体細胞層、脳室帯の三層が別れ、錐体細胞層に強い発現が観察されるようになる。また隣り合う歯状回の顆粒細胞層にもdab1の発現が観察される。海馬についてもP3でもdab1の発現は維持される。海馬においても、大脳新皮質と同様、Dab1の発現領域はReelinを発現するCajal-Retzius細胞の存在する辺縁帯に隣接した領域で観察される。小脳については、妊娠13.5日目の脳室帯、外顆粒層、分化帯に発現が見られ、妊娠18.5日目から生後３日では、プルキンエ細胞層で発現が観察される。また、妊娠18.5日目ではReelinを強く発現する顆粒細胞が存在する、外顆粒層に隣接してプルキンエ細胞層が存在し、小脳においても相補的な発現パターンを示す。Dab1は免疫組織化学染色が難しく、どの様な細胞に、どのような細胞内分布で発現しているのかは詳しくは知られていないが、免疫組織化学染色に成功しているグループによる報告と、dab1変異マウスで観察される移動障害とを考えあわせて、dab1は主には、大脳新皮質や海馬では興奮性神経細胞、小脳ではプルキンエ細胞に発現していると考えられている。 | |||
BGEM | BGEM | ||
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前述の通り、dab1のノックアウトマウス及び、自然変異マウスで、大脳新皮質、海馬、小脳、脊髄等の神経細胞移動が障害されていることから、Dab1は神経細胞移動において大変重要な役割を行ってると考えられている。他の組織・臓器における機能についてはいくつか報告があるのみで、あまりよくわかっていない。 | 前述の通り、dab1のノックアウトマウス及び、自然変異マウスで、大脳新皮質、海馬、小脳、脊髄等の神経細胞移動が障害されていることから、Dab1は神経細胞移動において大変重要な役割を行ってると考えられている。他の組織・臓器における機能についてはいくつか報告があるのみで、あまりよくわかっていない。 | ||
=== | ===大脳新皮質発生で観察されるDab1欠損による発生異常=== | ||
大脳新皮質の興奮性神経細胞は脳室帯で誕生後、脳の表面方向に移動し、最初期に誕生した神経細胞で形成されるプレプレートと呼ばれる細胞層の間に入り込んで、これをCajal-Retzius細胞を含む辺縁帯とサブプレートと呼ばれる二つの層に分離する（プレプレートスプリッティング）。神経細胞は辺縁帯の直下で移動を終了し、樹状突起を発達させて最終分化を行なう。神経細胞は次々に脳室帯で誕生して脳表面方向に移動するが、誕生時期の遅い神経細胞は誕生時期の早い神経細胞に追い越され、より脳の表層側に配置されるようになる。この配置パターンは“インサイドアウト”と呼ばれ、ほ乳類の大脳新皮質でのみ観察される特徴的な細胞構築様式である。 | 大脳新皮質の興奮性神経細胞は脳室帯で誕生後、脳の表面方向に移動し、最初期に誕生した神経細胞で形成されるプレプレートと呼ばれる細胞層の間に入り込んで、これをCajal-Retzius細胞を含む辺縁帯とサブプレートと呼ばれる二つの層に分離する（プレプレートスプリッティング）。神経細胞は辺縁帯の直下で移動を終了し、樹状突起を発達させて最終分化を行なう。神経細胞は次々に脳室帯で誕生して脳表面方向に移動するが、誕生時期の遅い神経細胞は誕生時期の早い神経細胞に追い越され、より脳の表層側に配置されるようになる。この配置パターンは“インサイドアウト”と呼ばれ、ほ乳類の大脳新皮質でのみ観察される特徴的な細胞構築様式である。 | ||
Dab1欠損マウスでは神経細胞は正常に産生され、神経細胞はプレプレートの間に入ることが出来ず、プレプレートスプリッティングが起らない。その為、辺縁帯が存在しない。後続の神経細胞は、先に誕生した神経細胞を追い越すことが出来ずに、脳表面から順番に深層に積み重なって行き、“アウトサイドイン”と呼ばれる異常な異常な層構造を形成するようになり、大体の層構造が逆転する異常が観察される。異常な層構造中には、internal plexiform zoneと呼ばれる細胞密度の低い領域が散在し、この部分に視床からサブプレートに投射するアクソンが走行し、また、興奮性神経細胞からは樹状突起がこの領域に向かい展開される。 | Dab1欠損マウスでは神経細胞は正常に産生され、神経細胞はプレプレートの間に入ることが出来ず、プレプレートスプリッティングが起らない。その為、辺縁帯が存在しない。後続の神経細胞は、先に誕生した神経細胞を追い越すことが出来ずに、脳表面から順番に深層に積み重なって行き、“アウトサイドイン”と呼ばれる異常な異常な層構造を形成するようになり、大体の層構造が逆転する異常が観察される。異常な層構造中には、internal plexiform zoneと呼ばれる細胞密度の低い領域が散在し、この部分に視床からサブプレートに投射するアクソンが走行し、また、興奮性神経細胞からは樹状突起がこの領域に向かい展開される。 | ||
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dab1欠損により引き起こされるこれらの神経細胞の移動障害が、dab1が欠損した細胞自身の障害によるものなのか、あるいは、dab1を欠損した周囲の細胞によって引き起こされた二次的な原因によるものなのか、あるいは両方なのか、Dab1の機能を解明する上で、焦点となった。この問題を解決するため、野生型Dab1を持つ細胞とDab1を欠損した細胞のキメラマウスが作成された。その結果、野生型のDab1を持つ細胞群がDab1を欠損した細胞群の上に配置されるような大脳新皮質（スーパーコルテックス）が形成される一方、少数の野生型細胞がDab1欠損細胞群中に取り込まれることが示された。この結果より、Dab1欠損による細胞の移動障害は主には細胞内因性の障害によって引き起こされているが、一部は周囲の細胞の障害にも影響されていることが示唆された。また、dab1を欠損したyotariマウスにdab1をin utero エレクトロポレーション（electroporation)法により、導入してやることにより、Dab1をレスキューした場合においてもdab1を導入された神経細胞はDab1を欠損した神経細胞を追い越して、脳表層まで到達し、プレプレートスプリッティングも引き起こすことから、dab1欠損による移動障害が主には細胞内在性に引き起こされていることが示唆されている。 | dab1欠損により引き起こされるこれらの神経細胞の移動障害が、dab1が欠損した細胞自身の障害によるものなのか、あるいは、dab1を欠損した周囲の細胞によって引き起こされた二次的な原因によるものなのか、あるいは両方なのか、Dab1の機能を解明する上で、焦点となった。この問題を解決するため、野生型Dab1を持つ細胞とDab1を欠損した細胞のキメラマウスが作成された。その結果、野生型のDab1を持つ細胞群がDab1を欠損した細胞群の上に配置されるような大脳新皮質（スーパーコルテックス）が形成される一方、少数の野生型細胞がDab1欠損細胞群中に取り込まれることが示された。この結果より、Dab1欠損による細胞の移動障害は主には細胞内因性の障害によって引き起こされているが、一部は周囲の細胞の障害にも影響されていることが示唆された。また、dab1を欠損したyotariマウスにdab1をin utero エレクトロポレーション（electroporation)法により、導入してやることにより、Dab1をレスキューした場合においてもdab1を導入された神経細胞はDab1を欠損した神経細胞を追い越して、脳表層まで到達し、プレプレートスプリッティングも引き起こすことから、dab1欠損による移動障害が主には細胞内在性に引き起こされていることが示唆されている。 | ||
では、Dab1の欠損により、何が一次的に障害されているのか？、この問題を解明する為に、周囲の細胞が正常な環境下で、一部の神経細胞でのみDab1の機能を阻害し、dab1の欠損によりどんな移動障害が引き起こされるのかが詳細に観察された。大脳新皮質の興奮性神経細胞は誕生時期の違いにより、異なる移動過程を経ることが知られている。早生まれの神経細胞は脳室帯(ventricular zone)で誕生した後、もともと脳の表層にアンカリングしてあった、突起を用いて細胞体を引き上げるsomal translocationと呼ばれる形式で、移動する。一方、遅生まれの神経細胞は脳室帯で誕生した後、脳室下帯（subventricular zone)の直上で多極性の形態（多極性細胞）をとり、突起を出したり縮めたりしながら多極性移動（multipolar migration）と呼ばれる移動を行い、その後、紡錘形の形態にトランスフォームして脳表面にlocomotionと呼ばれる方式で移動する。さらに、脳表面付近では神経細胞の進行方向に長く伸びた先導突起（leading process）と呼ばれる突起を辺縁帯（marginal | では、Dab1の欠損により、何が一次的に障害されているのか？、この問題を解明する為に、周囲の細胞が正常な環境下で、一部の神経細胞でのみDab1の機能を阻害し、dab1の欠損によりどんな移動障害が引き起こされるのかが詳細に観察された。大脳新皮質の興奮性神経細胞は誕生時期の違いにより、異なる移動過程を経ることが知られている。早生まれの神経細胞は脳室帯(ventricular zone)で誕生した後、もともと脳の表層にアンカリングしてあった、突起を用いて細胞体を引き上げるsomal translocationと呼ばれる形式で、移動する。一方、遅生まれの神経細胞は脳室帯で誕生した後、脳室下帯（subventricular zone)の直上で多極性の形態（多極性細胞）をとり、突起を出したり縮めたりしながら多極性移動（multipolar migration）と呼ばれる移動を行い、その後、紡錘形の形態にトランスフォームして脳表面にlocomotionと呼ばれる方式で移動する。さらに、脳表面付近では神経細胞の進行方向に長く伸びた先導突起（leading process）と呼ばれる突起を辺縁帯（marginal zone）付近まで伸ばし、核を引き上げる様に移動するターミナルトランスロケーションと呼ばれる移動様式により移動を行う。in utero electroporationによってdab1のノックダウンが行われた結果、dab1がノックダウンされた神経細胞は脳の表層近くまで移動するが、移動の最終過程であるターミナルトランスロケーションと樹状突起の発達が障害されていることが示された。この実験結果ではターミナルトランスロケーションも阻害されていることから、樹状突起形成の発達障害はその二次的な影響との可能性も考えられるが、海馬において生後3日からに次期特異的にdab1をノックアウトした場合に、樹状突起形成に異常が生じること、dab1ノックアウトマウスから得られた神経細胞を培養した場合にも樹状突起の形成に障害が生じることから、dab1には樹状突起形成を促進する働きがあることが示唆された。また、dab1のコンディショナルノックアウトマウスを用いた実験では、早生まれの細胞ではsomal translocationが阻害され、遅生まれの細胞ではteriminal translocationが阻害されていることが示された。 | ||
一方Dab1が神経細胞移動を制御する分子メカニズムについてはN-cadherinとIntegrinが関与していることが実験的に示唆されている。大脳新皮質神経細胞のReelin刺激により、Dab1のチロシンリン酸化が起こり、ここにCrkを介するC3Gの活性化、続くRap1の活性化が起こることが培養細胞を用いた実験により知られていた為、Rap1のエフェクターとして既に知られていたN-cadherinの関与が調べられた。実験では、Rap1の不活性化因子であるRap1GAPを強制発現させることにより、Rap1を不活性化した。これにより、神経細胞の移動が障害され、皮質板に侵入する神経細胞の割合が減少する。Rap1はN-cadherinの細胞内から細胞表面への輸送に関わっていることが知られていたことから、Rap1GAPとN-cadherinを同時に発現させた所、Rap1GAPによる神経細胞の移動障害が抑制されることが示唆された。この結果により、間接的ではあるが、Reelin-Dab1シグナルがRap1を介してN-cadherinの細胞表面への輸送制御を行うことにより、神経細胞移動を制御している可能性が示唆された。 | |||
一方、Rap1の阻害タンパク質SpaIをin utero electroporationにより発現させた場合、発現量が多い場合、多極性移動からロコモーションへの変換を阻害し、弱い場合は原皮質帯（primitive cortical zone、PCZ）と呼ばれる部位への神経細胞の移動を阻害することから、Rap1は神経細胞の移動を多くのステップで制御している可能性が示された。のneuN陰性の活性化型Integrin beta 1を認識する抗体がターミナルトランスロケーションが起る原皮質帯（primitive cortical zone、PCZ）と呼ばれる部位に多いこと、reelerマウスやyotariマウスではIntegrin beta1の活性化が観察されないこと、Integrinのリガンドであるfibronectinが辺縁帯に多いこと等から、IntegrinがReelin-dab1シグナル依存性にターミナルトランスロケーションを制御する分子の候補となった。Reelin刺激した神経細胞はfibronectinに対する接着性が上昇すること等から、Rap1の下流分子として知られていた | |||
しかしながら、N-cadhelinをリーラーマウスに導入しただけでは、神経細胞の移動がレスキューされないし、また、Integrin beta1のノックアウトマウスやコンディショナルノックアウトマウスではリーラーフェノタイプにはならないことから、これらの働きは部分的であるか、このような実験条件では完全にはレスキューできないことが示唆されている。 | |||