「FM1-43」の版間の差分

''東京大学 大学院医学系研究科''<br>

== FM1-43とは ==

[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1. FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識'''<br>FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] 　Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、[[細胞膜]]を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、[[分泌小胞]]の動態解析に広く用いられる。

　疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい<ref><pubmed> 10202529 </pubmed></ref>。 FM1-43 の炭素鎖数は 4であり、解離時定数τ_dissは 8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τ_diss=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84（炭素鎖数 5）は離脱に時間がかかる(τ_diss=36 ms)<ref><pubmed> 19580748 </pubmed></ref>。  

　FM1-43の[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には1光子では波長 480 nm光、2光子では波長 840 nm光が頻用される。

　波長 480nm光の高出力励起（～150 μW）にて[[wikipedia:3,3'-Diaminobenzidine|ジアミノベンチジン]]（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素である FM1-43FXと DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[電子顕微鏡]]観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。

[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3. 開口放出に伴う FM 蛍光の変化'''<br>膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる。]]

[[ファイル:Takahashinoriko fig 4.jpg|thumb|250px|'''図4. シナプス前終末における小胞プール'''<br>即時放出可能プール、再循環プール、静止プールの存在が生理学的な手法や電子顕微鏡による検討などで示唆されている。]]

　シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、[[活性帯]] ([[active zone]])にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を[[即時放出可能プール]] ([[readily releasable pool]], [[RRP]]）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後 30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて[[即時放出可能プール]]に再び至る。この課程を[[リサイクリング]]と呼び、その小胞の集合体が[[再循環プール]]（[[Recycling pool]])である。即時放出可能プールと再循環プールを総合して、[[全放出可能プールあるいは全リサイクリングプール]] ([[total recycling pool]], [[TRP]])という呼称が使われる（図 4）。

　細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え、[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染め出し、その後色素を含まない溶液で細胞外を還流し、外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうど RRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて wash outをすると RRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPは TRPの 10-30%程度と推定されており<ref><pubmed>　15044806 </pubmed></ref>、TRPが40個程度の小さなシナプスでは RRPの小胞数は 4-12個となる。

　次に、TRPを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する（脱染色、destaining 図3右）。この脱染色の時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を [RRP]、その放出確率を Pvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均で Pv [RRP]となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激による TRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は k [TRP]となる。よって、Pv [RRP] = k [TRP] となり、これからPv = k [RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。この Pvと、一回の刺激によりある終末から開口放出が起きる確率 Pr との間には、RRP内の小胞の放出確率が等しければ<math>Pr=1-(1-Pv)^{[RRP]}</math>という関係がある。Prも FM1-43を用いて直接求めた例がある<ref><pubmed> 9136769 </pubmed></ref> 。

　FM1-43によって染めることができる TRPの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%にすぎない。<ref><pubmed>　15044806 </pubmed></ref>。 電子顕微鏡的には同定されるがリサイクリングされ難いシナプス小胞の群を[[静止プール]][[ resting pool]]あるいは [[reserve pool]]と呼ぶ(図 4）。静止プール内の小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。

　開口放出した顆粒はactive zoneの周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、[[神経筋接合部]]では 60秒と見積もられた。TRPを FM1-43で染めた後、DABを光変換して電顕で見ると染色された小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。

　FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する[[完全融合]]型（full fusion）と、離脱しない[[不完全融合]]型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。

　FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。

　また、[[下垂体]][[前葉細胞]] ([[lactotrophs]]) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。