「FM1-43」の版間の差分

'''==要約==''' <br>FM 色素は[[wikipedia:ja:脂質二重層|脂質二重膜]]を可逆的に染める蛍光色素で、[[シナプス前終末]]の機能や[[wikipedia:ja:分泌|分泌]]現象の計測に活用されている。  

'''==目次== <br>'''<br>

1. FM1-43 とは

2. 分子構造

3. 蛍光特性  

4. 応用例　 4-1 [[シナプス]]前機能の解析　　

   

              4-2 開口放出現象（[[エクソサイトーシス]]）の可視化　　

              4-3 分泌小胞の直径測定 

'''　==蛍光特性==<br>'''FM1-43 の、[[wikipedia:ja:励起状態|励起]]には 1光子では波長 480 nm光、2光子では波長 840 nm 光が頻用される。<br>極大蛍光波長はリポソーム中にて 580 nm である。<br>波長 480 nm光の高出力励起（～150 μW）にてジアミノベンゼン（DAB）の光変換（photoconversion） を起こす。そのため、[[wikipedia:ja:アルデヒド|アルデヒド]]で固定可能な色素：FM1-43FX と DAB を細胞に与え、光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、[[wikipedia:ja:電子顕微鏡観察|電子顕微鏡観察]]が可能となる。FM1-43 を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。 <br>

'''<br>==応用例=='''<br>'''[[wikipedia:ja:シナプス|シナプス]]前機能の解析'''<br>'''　・[[wikipedia:ja:シナプス|シナプス]]前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定'''<br>細胞外を FM1-43 で還流中に、短い放出刺激を与え（例 20 Hz、30 発）、開口放出([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染める。 <br><br>[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|center|600px|図3]]<br>[[シナプス小胞]]は 30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる。その後、細胞外を、色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out する。このような loading 過程を経て示される蛍光量は、30回の刺激時に開口放出した小胞にあたり Readily releasable pool （RRP）のサイズの指標となる。カエル [[神経筋接合部]]の場合、RRP の小胞数は神経終末内小胞の約 15％（12-17％）と報告された<ref><pubmed>　15044806 </pubmed></ref>。<br>

<br>次に、細胞外色素フリーの状態で放出刺激を与えると、前段階で染められた[[シナプス小胞]]は細胞膜と融合し、細胞外液への拡散により神経終末の蛍光は減弱する（destaining）。この減弱の程度や時間経過から、開口放出の量と速度が評価できる。蛍光減弱の時間経過は single exponential に近似されることから、放出確率 (Release probability, Pr) は蛍光減弱の時定数に反比例すると考えられる。Prの計算法として、（Recycling pool の小胞数×0.63）/ (37％に蛍光減弱するまでに与えた電気パルス数）で示す方法<ref><pubmed> 18701072 </pubmed></ref> が提起された。より簡易的には、FM1-43 の蛍光半減期の逆数<ref><pubmed> 11426227 </pubmed></ref>で示されるケースもある。<br><br>'''　・[[シナプス小胞]]の動態の解析'''<br>開口放出した顆粒は active zone の周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（recycle）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、[[神経筋接合部]]では 60秒と見積もられた。そこで Recycling pool（= RRP + Reserve pool）の測定は、RRP 測定時よりも長い時間電気刺激を与え、色素をロードする事により達成できる（例 10Hz 900 発）。リサイクルされた小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。<br><br>'''　・[[膜融合]]様式の解析'''<br>FM 色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。<br>FM2-10 や FM1-43 色素を用い、小胞膜から離脱する完全融合型（full fusion）と、離脱しない不完全融合型（incomplete fusion）の識別が行われた<ref><pubmed> 9707119 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 12354398 </pubmed></ref>。

'''<br>開口放出現象の可視化'''<br>FM1-43 を網膜双極性細胞の[[シナプス小胞]]に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。<br>また、下垂体前葉細胞 (lactotrophs) や膵島細胞においても、ホルモンを含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43 蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>　12193788 </pubmed></ref>。 　　　　　　　　　　　　。

<br><references />