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== 原理と適用例 == | == 原理と適用例 == | ||
[[Image:DD-fig1rev.jpg|thumb|right|300px|'''図1 Differential Displayの結果例'''。 条件付けを行ったナメクジ''[[wikipedia:Limax maximus|Limax maximus]]''個体(P, Paired)及び対照群の個体(U, Unpaired)、各群2サンプルから調整したtotal RNAを用いてDDを行った。 用いたOligodTMN primer (N = C)及びArbitrary primerは上部に示す。群間で差があり、且つ2サンプルで再現性のあるバンドを探索した。多くのバンドが再現性良く現れており、群間で差は認められない。*で示すバンドは同一群内で異なる結果を示していることから、本実験では再現性が無い、と判断された。矢印で示す1及び2がPaired群で増加、3及び4が減少しているバンドを示す。右パネルはDNAマーカーを示す。]] | |||
遺伝子から転写されたmRNAの量は、遺伝子機能の量的な面を反映していると考えられるため、遺伝子の発現量から機能を推測しようというのが、この遺伝子発現解析の基本的な概念である。本技法は、1992年にLiangとPardeeにより、mRNAレベルで[[wikipedia:ja:真核生物|真核細胞]]の試料間で、遺伝子発現の同定比較を行うことできる技術として発表された<ref name="Liang_Pardee_Science" /><ref name="Liang_Biotech" />。形態的、遺伝学的、または実験的処置等に異なる試料間で、どの遺伝子発現に変化・差異があるかを見出すことができる。 | 遺伝子から転写されたmRNAの量は、遺伝子機能の量的な面を反映していると考えられるため、遺伝子の発現量から機能を推測しようというのが、この遺伝子発現解析の基本的な概念である。本技法は、1992年にLiangとPardeeにより、mRNAレベルで[[wikipedia:ja:真核生物|真核細胞]]の試料間で、遺伝子発現の同定比較を行うことできる技術として発表された<ref name="Liang_Pardee_Science" /><ref name="Liang_Biotech" />。形態的、遺伝学的、または実験的処置等に異なる試料間で、どの遺伝子発現に変化・差異があるかを見出すことができる。 | ||
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== 利点と不利点 == | == 利点と不利点 == | ||
本法は、単一ゲル上で多数の試料のバンド分布を同時に比較できることから効率良く遺伝子発現量の差が検出できるため、組織や細胞が発現する遺伝子とその発現量の解析、つまりtranscription imageの研究分野に急速に普及した。ただし、任意プライマーを用いてPCR反応を行うことから再現性が高いとは言えず、また、高感度であるが故にPCRの条件設定を厳密に行わないと擬陽性のバンドも出やすい。そのため、2000年代半ばには、高速かつ高感度で大量解析可能な[[DNAアレイ]]（DNAチップ）、RNA-seq、定量的[[wikipedia:ja:リアルタイムPCR|リアルタイムPCR]]（RT-PCR）などの技術の登場によってその相対的重要性は低下している<ref>英語版WikipediaのDifferential displayの項目。http://en.wikipedia.org/wiki/Differential_display</ref>。しかしながら、DNAアレイに比較して、ディファレンシャルディスプレイ法はコスト面、所要時間で未だ有利であり、出発材料が少量でも解析を行えるという利点も有する。また通常のDNAアレイと異なり、ディファレンシャルディスプレイ法では新規遺伝子の検出が可能であることなどの利点もあることから、今後も多くの分野で適用が期待される。 | 本法は、単一ゲル上で多数の試料のバンド分布を同時に比較できることから効率良く遺伝子発現量の差が検出できるため、組織や細胞が発現する遺伝子とその発現量の解析、つまりtranscription imageの研究分野に急速に普及した。ただし、任意プライマーを用いてPCR反応を行うことから再現性が高いとは言えず、また、高感度であるが故にPCRの条件設定を厳密に行わないと擬陽性のバンドも出やすい。そのため、2000年代半ばには、高速かつ高感度で大量解析可能な[[DNAアレイ]]（DNAチップ）、RNA-seq、定量的[[wikipedia:ja:リアルタイムPCR|リアルタイムPCR]]（RT-PCR）などの技術の登場によってその相対的重要性は低下している<ref>英語版WikipediaのDifferential displayの項目。http://en.wikipedia.org/wiki/Differential_display</ref>。しかしながら、DNAアレイに比較して、ディファレンシャルディスプレイ法はコスト面、所要時間で未だ有利であり、出発材料が少量でも解析を行えるという利点も有する。また通常のDNAアレイと異なり、ディファレンシャルディスプレイ法では新規遺伝子の検出が可能であることなどの利点もあることから、今後も多くの分野で適用が期待される。 | ||
なお、[[wikipedia:ja:蛋白質|蛋白質]]レベルにおける発現量を比較する「蛋白質ディファレンシャルディスプレイ法」という手法もある<ref>'''平野久''' | なお、[[wikipedia:ja:蛋白質|蛋白質]]レベルにおける発現量を比較する「蛋白質ディファレンシャルディスプレイ法」という手法もある<ref>'''平野久'''<br>タンパク質のアミノ酸配列と翻訳後修飾の分析<br>蛋白質をみるー構造と挙動（長谷俊治、高尾敏文、高木淳一編）化学同人: 2009 pp. 1-32</ref>。これは、複数種の特定の細胞試料間で蛋白質の発現パターンの違いを分析する方法であり、一般的には二次元[[wikipedia:Gel electrophoresis|ゲル電気泳動]]で各細胞の蛋白質を分離し、そのパターンの差を比較する方法である。 | ||
== 方法と手順 == | == 方法と手順 == | ||
以下、通常のmRNA試料を対象としたディファレンシャルディスプレイ法について説明する (図2)。[[Image:DDRT-fig3.jpg|thumb| | 以下、通常のmRNA試料を対象としたディファレンシャルディスプレイ法について説明する (図2)。[[Image:DDRT-fig3.jpg|thumb|right|300px|図2 ディファレンシャルディスプレイ法の手順]] | ||
細胞中で発現したmRNAすべてを[[wikipedia:ja:逆転写|逆転写]]しcDNAを得た後、これを鋳型にして複数の混合プライマーを用いたPCRを行う。ここで、特異性を持たせずできるだけ多くの種類のcDNA断片を増幅するよう設定した複数のプライマーを用いることにより、非常に多数のバンドが得られる。１つの細胞で発現し得る約15,000種類の遺伝子すべての発現を網羅して探索するために、3種類のアンカープライマーと20種類の混成プライマー(10 mer)を用いてPCRを行う。得られたバンドの強弱を遺伝子発現の強度の指標とし、特定の物質添加の有無などさまざまな操作・環境の違いによりその細胞のどの遺伝子が変化しているかを見出す。 | 細胞中で発現したmRNAすべてを[[wikipedia:ja:逆転写|逆転写]]しcDNAを得た後、これを鋳型にして複数の混合プライマーを用いたPCRを行う。ここで、特異性を持たせずできるだけ多くの種類のcDNA断片を増幅するよう設定した複数のプライマーを用いることにより、非常に多数のバンドが得られる。１つの細胞で発現し得る約15,000種類の遺伝子すべての発現を網羅して探索するために、3種類のアンカープライマーと20種類の混成プライマー(10 mer)を用いてPCRを行う。得られたバンドの強弱を遺伝子発現の強度の指標とし、特定の物質添加の有無などさまざまな操作・環境の違いによりその細胞のどの遺伝子が変化しているかを見出す。 | ||
#アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） | #アンカープライマーによるmRNAの選択的逆転写（第1鎖合成） | ||
#:比較したい２種類（またはそれ以上）の細胞からそれぞれ抽出したmRNAを、ポリ(A)鎖と結合するアンカープライマーと逆転写酵素を用いた逆転写反応によってcDNAに変換する。アンカープライマーとしはT（チミジン）12個からなる[[wikipedia:ja:オリゴヌクレオチド|オリゴヌクレオチド]]の3’端に、A,G, | #:比較したい２種類（またはそれ以上）の細胞からそれぞれ抽出したmRNAを、ポリ(A)鎖と結合するアンカープライマーと逆転写酵素を用いた逆転写反応によってcDNAに変換する。アンカープライマーとしはT（チミジン）12個からなる[[wikipedia:ja:オリゴヌクレオチド|オリゴヌクレオチド]]の3’端に、A,G,Cのうちの1種のヌクレオチド1個を付加したものを用いる（T<sub>12</sub>N, N=A, G, or C）。あるいは、T<sub>11</sub>MN（但し、M=A, G, Cの混合、N=A, G, CまたはTを用いることもある ) | ||
#任意プライマーによるcDNAの選択的第2鎖合成とPCRによる増幅 | #任意プライマーによるcDNAの選択的第2鎖合成とPCRによる増幅 | ||
#:次に、合成されたcDNAを鋳型に、アンカープライマーと任意の混成塩基配列を持つ（通常10merの）オリゴヌクレオチド群をプライマーとしてPCRを行う。これによって任意の共通塩基配列をもつ複数のcDNA断片を、同時にPCR増幅する。この結果、両端をアンカープライマーと任意プライマーの配列で置換された分子が生じる。 | #:次に、合成されたcDNAを鋳型に、アンカープライマーと任意の混成塩基配列を持つ（通常10merの）オリゴヌクレオチド群をプライマーとしてPCRを行う。これによって任意の共通塩基配列をもつ複数のcDNA断片を、同時にPCR増幅する。この結果、両端をアンカープライマーと任意プライマーの配列で置換された分子が生じる。 | ||