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「機能欠失実験」の版間の差分
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細
→発現量の減少
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目的とする遺伝子そのものを破壊することで目的遺伝子の発現あるいは機能を完全に抑制させる。 | 目的とする遺伝子そのものを破壊することで目的遺伝子の発現あるいは機能を完全に抑制させる。 | ||
==== | ==== ジーンターゲティング==== | ||
目的の遺伝子に任意の変異を導入する手法をジーンターゲティングという。本法による遺伝子破壊を動物個体レベルで行うためには[[ES細胞]]が必要であったため[[マウス]]でのみ可能であったが近年[[ラット]]でもES細胞が樹立されジーンターゲティングによる遺伝子ノックアウトが可能になった。また、ES細胞の代わりにiPS細胞を用いたジーンターゲティングも行われるようになった。 | 目的の遺伝子に任意の変異を導入する手法をジーンターゲティングという。本法による遺伝子破壊を動物個体レベルで行うためには[[ES細胞]]が必要であったため[[マウス]]でのみ可能であったが近年[[ラット]]でもES細胞が樹立されジーンターゲティングによる遺伝子ノックアウトが可能になった。また、ES細胞の代わりにiPS細胞を用いたジーンターゲティングも行われるようになった。 | ||
==== | ==== 人工ヌクレアーゼ==== | ||
[[Image:Takahirohirabayashi fig 1.jpg|thumb|right|300px|'''図1．人工ヌクレアーゼの構造''']] | [[Image:Takahirohirabayashi fig 1.jpg|thumb|right|300px|'''図1．人工ヌクレアーゼの構造''']] | ||
[[Image:Takahirohirabayashi fig 2.jpg|thumb|right|300px|'''図2．人工ヌクレアーゼによる遺伝子破壊''']] | [[Image:Takahirohirabayashi fig 2.jpg|thumb|right|300px|'''図2．人工ヌクレアーゼによる遺伝子破壊''']] | ||
[[wikipedia:ja:人工ヌクレアーゼ|人工ヌクレアーゼ]]は、任意の塩基配列に結合するようにデザインされたDNA結合ドメインとDNA切断酵素の切断ドメインを連結させたタンパク質であり、任意の塩基配列を切断すること可能な酵素である（図1）。この人工ヌクレアーゼにはDNA配列を認識し、切断するという原理は共通だが、ジンクフィンガーのDNA結合ドメインを利用してDNA配列を認識する[[wikipedia:Zinc Finger nuclease|Zinc Finger nuclease]] (ZFN), [[wikipedia:TALEs|TALEs]]のDNA結合ドメインを利用しDNA配列を認識する[[wikipedia:TALEN|TALEN]]の2種類が主に使用されている。 | |||
これら人工ヌクレアーゼを導入した細胞内では特定の[[wikipedia:ja:DNA|DNA]]がdouble-strand breakするが、これを修復するためにNHEJ ([[wikipedia:Non-Homologous End Joining|Non-Homologous End Joining | これら人工ヌクレアーゼを導入した細胞内では特定の[[wikipedia:ja:DNA|DNA]]がdouble-strand breakするが、これを修復するためにNHEJ ([[wikipedia:Non-Homologous End Joining|Non-Homologous End Joining]]機構が働く。この際、高頻度で[[wikipedia:ja:塩基対|塩基対]]の欠失、挿入などの[[wikipedia:ja:修復エラー|修復エラー]]が生じ、結果的に[[wikipedia:ja:フレームシフト|フレームシフト]]を起こすことで遺伝子がノックアウトされる（図2）。この手法はES細胞を必要としないため、これまでES細胞が樹立されておらずジーンターゲティングによる遺伝子ノックアウトが不可能であった動物種でも使用例が報告されている。 | ||
=== 遺伝子ノックダウン === | === 遺伝子ノックダウン === | ||
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ジーンターゲティングによる遺伝子ノックアウトが遺伝子中の[[wikipedia:ja:翻訳|翻訳]]領域を破壊するのに対し、遺伝子ノックダウンでは遺伝子中の[[wikipedia:ja:polyA付加配列|polyA付加配列]]など[[wikipedia:ja:発現制御|発現制御]]領域を欠損、あるいは変異を導入することでおこなわれる。本法も動物個体レベルで行うためにはES細胞が必要であるため、適用できる動物種に限りがある。 | ジーンターゲティングによる遺伝子ノックアウトが遺伝子中の[[wikipedia:ja:翻訳|翻訳]]領域を破壊するのに対し、遺伝子ノックダウンでは遺伝子中の[[wikipedia:ja:polyA付加配列|polyA付加配列]]など[[wikipedia:ja:発現制御|発現制御]]領域を欠損、あるいは変異を導入することでおこなわれる。本法も動物個体レベルで行うためにはES細胞が必要であるため、適用できる動物種に限りがある。 | ||
==== | ==== アンチセンスオリゴヌクレオチド==== | ||
標的とする遺伝子のmRNA配列に対し相補的な塩基配列を持つ短い[[wikipedia:ja:核酸|核酸]]（[[wikipedia:ja:アンチセンスオリゴヌクレオチド|アンチセンスオリゴヌクレオチド]]）を細胞外から導入すると、目的のmRNAと結合しその翻訳を阻害しその発現を抑制する。 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内で不安定であるためリン酸基の酸素の一つが[[wikipedia:ja:チオール|チオール]](-SH)化(-SH)した[[wikipedia:ja:ホスホロチオエート結合オリゴ|ホスホロチオエート結合オリゴ]] (s-oligo)や、RNAオリゴヌクレオチドのリボースを[[wikipedia:ja:モルフォリノ環|モルフォリノ環]]、リン酸基を[[wikipedia:ja:ホスホロジアミダイト|ホスホロジアミダイト]]へ、[[wikipedia:ja:ウラシル|ウラシル]]を[[wikipedia:ja:チミン|チミン]]にそれぞれ置換し、安定性の向上、細胞毒性の軽減させたモルフォリノアンチセンスオリゴなどが開発されてきた。しかし、現在では遺伝子発現抑制効果が高い2本鎖RNAによる[[RNA干渉]]を利用した方法に移行している。 | 標的とする遺伝子のmRNA配列に対し相補的な塩基配列を持つ短い[[wikipedia:ja:核酸|核酸]]（[[wikipedia:ja:アンチセンスオリゴヌクレオチド|アンチセンスオリゴヌクレオチド]]）を細胞外から導入すると、目的のmRNAと結合しその翻訳を阻害しその発現を抑制する。 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内で不安定であるためリン酸基の酸素の一つが[[wikipedia:ja:チオール|チオール]](-SH)化(-SH)した[[wikipedia:ja:ホスホロチオエート結合オリゴ|ホスホロチオエート結合オリゴ]] (s-oligo)や、RNAオリゴヌクレオチドのリボースを[[wikipedia:ja:モルフォリノ環|モルフォリノ環]]、リン酸基を[[wikipedia:ja:ホスホロジアミダイト|ホスホロジアミダイト]]へ、[[wikipedia:ja:ウラシル|ウラシル]]を[[wikipedia:ja:チミン|チミン]]にそれぞれ置換し、安定性の向上、細胞毒性の軽減させたモルフォリノアンチセンスオリゴなどが開発されてきた。しかし、現在では遺伝子発現抑制効果が高い2本鎖RNAによる[[RNA干渉]]を利用した方法に移行している。 | ||
==== RNA干渉 | ==== RNA干渉==== | ||
RNA干渉とは21-23塩基からなる対からなる[[short interfering RNA]]（[[siRNA]]）と呼ばれる2本鎖RNAが相補的な配列を持つ生体内のmRNAと結合し、そのmRNAを分解する現象である。 この現象はウイルスなどに対する生体防御機構と考えられているが、近年ではこの現象を利用して特定の遺伝子発現の抑制を誘導する実験系が種々の動植物で確立され、さらにこれらを応用した疾患に対する治療法が開発されている。siRNAそのものを細胞内へ導入し、遺伝子発現抑制を誘導するためには大量のsiRNAが必要であることやその効果が一過性であることから、近年ではこのsiRNAを発現する[[wikipedia:ja:ベクター|ベクター]]として導入する方法が多く用いられている。 | RNA干渉とは21-23塩基からなる対からなる[[short interfering RNA]]（[[siRNA]]）と呼ばれる2本鎖RNAが相補的な配列を持つ生体内のmRNAと結合し、そのmRNAを分解する現象である。 この現象はウイルスなどに対する生体防御機構と考えられているが、近年ではこの現象を利用して特定の遺伝子発現の抑制を誘導する実験系が種々の動植物で確立され、さらにこれらを応用した疾患に対する治療法が開発されている。siRNAそのものを細胞内へ導入し、遺伝子発現抑制を誘導するためには大量のsiRNAが必要であることやその効果が一過性であることから、近年ではこのsiRNAを発現する[[wikipedia:ja:ベクター|ベクター]]として導入する方法が多く用いられている。 | ||
== 機能の減弱 == | == 機能の減弱 == | ||