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=== | === ドナーとアクセプターの蛍光強度比を測定する方法 === | ||
ドナーおよびアクセプターの蛍光を取得後、ドナーとアクセプターの蛍光強度比が計算される。FRETが起きると、ドナーの蛍光強度が減少し、アクセプターの蛍光強度が増加する。現在、最も広く使用されている手法である。データを取得、解釈する際に注意しなければいけないポイントがある。 | |||
まず、ドナーの蛍光のアクセプターチャンネルへの漏れ込みである。これによって、SN比の減少の原因となる。改善点としては漏れ込みを極力抑える適切なバンドパスフィルターを用いることである。次に、ドナーおよびアクセプターのバックグラウンドは、FRET変化に影響を与えるため、サブトラクションすることで、より正しいFRET効率が得られる。次に、2分子間FRETで起きることであるが、ドナーとアクセプターの局在の違いは疑似FRETを生じる。リンカーで連結し1分子にすること、局在しているアクセプターの蛍光強度を計算することで修正することが可能である。 | |||
測定の際には蛍光強度の変化を測定することになるが、細胞などの試料においては、細胞の形状変化に伴う蛍光強度変化などが起きることから、実際にはドナーとアクセプターの蛍光強度の変化を取得することによって、これらのファクターを除外する。 | |||
=== ドナーの蛍光寿命を測定する方法 === | === ドナーの蛍光寿命を測定する方法 === | ||