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==== 人工ヌクレアーゼ==== | ==== 人工ヌクレアーゼ==== | ||
[[Image:Takahirohirabayashi fig 1.jpg|thumb|right|300px|'''図1．人工ヌクレアーゼの構造''']] | [[Image:Takahirohirabayashi fig 1.jpg|thumb|right|300px|'''図1．人工ヌクレアーゼの構造''']] | ||
[[Image:Takahirohirabayashi fig 2.jpg|thumb|right|300px|''' | [[Image:Takahirohirabayashi fig 2.jpg|thumb|right|300px|'''図2．DNA切断に伴う塩基対の欠失・挿入''']] | ||
[[wikipedia:ja:人工ヌクレアーゼ|人工ヌクレアーゼ]]は、任意の塩基配列に結合するようにデザインされたDNA結合ドメインとDNA切断酵素の切断ドメインを連結させたタンパク質であり、任意の塩基配列を切断すること可能な酵素である（図1）。この人工ヌクレアーゼにはDNA配列を認識し、切断するという原理は共通だが、ジンクフィンガーのDNA結合ドメインを利用してDNA配列を認識する[[wikipedia:Zinc Finger nuclease|Zinc Finger nuclease]] (ZFN)<ref><pubmed> 15806097 </pubmed></ref>, [[wikipedia:TALEs|TALEs]]のDNA結合ドメインを利用しDNA配列を認識する[[wikipedia:TALEN|TALEN]]<ref><pubmed> 21262818 </pubmed></ref>の2種類が主に使用されている。 | [[wikipedia:ja:人工ヌクレアーゼ|人工ヌクレアーゼ]]は、任意の塩基配列に結合するようにデザインされたDNA結合ドメインとDNA切断酵素の切断ドメインを連結させたタンパク質であり、任意の塩基配列を切断すること可能な酵素である（図1）。この人工ヌクレアーゼにはDNA配列を認識し、切断するという原理は共通だが、ジンクフィンガーのDNA結合ドメインを利用してDNA配列を認識する[[wikipedia:Zinc Finger nuclease|Zinc Finger nuclease]] (ZFN)<ref><pubmed> 15806097 </pubmed></ref>, [[wikipedia:TALEs|TALEs]]のDNA結合ドメインを利用しDNA配列を認識する[[wikipedia:TALEN|TALEN]]<ref><pubmed> 21262818 </pubmed></ref>の2種類が主に使用されている。 | ||
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[[Image:機能欠失実験図３.jpg|thumb|right|300px|'''図３． ''']] | [[Image:機能欠失実験図３.jpg|thumb|right|300px|'''図３． ''']] | ||
CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR-associated protein)システムは、バクテリアが有するウイルスなど対する免疫機構である。ウイルスやプラスミドなどの外来DNA断片が侵入してくると、バクテリアは自身のゲノム中のCRISPR座位と呼ばれる遺伝子領域に取り込み、これを鋳型にした短差CRISPR RNA (crRNA)を合成する。このcrRNAはトランス活性化型crRNA (tracrRNA) | CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR-associated protein)システムは、バクテリアが有するウイルスなど対する免疫機構である。ウイルスやプラスミドなどの外来DNA断片が侵入してくると、バクテリアは自身のゲノム中のCRISPR座位と呼ばれる遺伝子領域に取り込み、これを鋳型にした短差CRISPR RNA (crRNA)を合成する。このcrRNAはトランス活性化型crRNA (tracrRNA)およびCas9ヌクレアーゼと複合体を形成して、標的配列のDNAを切断する。この機構により再び侵入してきた外来DNAを切断することが出来る（図3A）<ref><pubmed> 20056882 </pubmed></ref><ref><pubmed> 21455174 </pubmed></ref>。 | ||
近年、このCRISPR/Cas9システムを応用してゲノムDNA上の任意の塩基配列を切断できる技術が開発された<ref><pubmed> 23287718 </pubmed></ref>。この方法では切断したい任意の塩基配列を持つcrRNAとtracrRNAを1分子のガイドRNA (gRNA)として、Cas9のmRNAまたはタンパク質と共に細胞に導入することで任意の塩基配列を切断すること可能である（図3B）。切断されたDNAは上述の人工ヌクレアーゼと同様に高頻度で塩基対の欠失、挿入などの修復エラーが生じるため、結果的に遺伝子がノックアウトされる遺伝子がノックアウトされる（図2）。本法はZFNやTALENに比して標的配列デザインの容易性などから頻用されている。 | |||
=== 遺伝子発現量減少（遺伝子ノックダウン） === | === 遺伝子発現量減少（遺伝子ノックダウン） === | ||
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[[Image:機能欠失実験図５.jpg|thumb|right|300px|''' | [[Image:機能欠失実験図５.jpg|thumb|right|300px|'''図５． ''']] | ||
また、目的のタンパク質が持つアミノ酸が[[リン酸化]]されることでその機能が増強する場合、そのアミノ酸をリン酸化を受けない他のアミノ酸に置換した変異体を発現することで目的タンパク質のリン酸化による機能の増強を抑制することができる。 一般的には[[wikipedia:ja:セリン|セリン]]、[[wikipedia:ja:スレオニン|スレオニン]]は[[wikipedia:ja:アラニン|アラニン]]、[[wikipedia:ja:チロシン|チロシン]]は[[wikipedia:ja:フェニルアラニン|フェニルアラニン]]、のように類似構造のアミノ酸に置換する。 | また、目的のタンパク質が持つアミノ酸が[[リン酸化]]されることでその機能が増強する場合、そのアミノ酸をリン酸化を受けない他のアミノ酸に置換した変異体を発現することで目的タンパク質のリン酸化による機能の増強を抑制することができる。 一般的には[[wikipedia:ja:セリン|セリン]]、[[wikipedia:ja:スレオニン|スレオニン]]は[[wikipedia:ja:アラニン|アラニン]]、[[wikipedia:ja:チロシン|チロシン]]は[[wikipedia:ja:フェニルアラニン|フェニルアラニン]]、のように類似構造のアミノ酸に置換する。 | ||