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=== 樹立の成功  ===
=== 樹立の成功  ===


 続いて、山中博士らは「ES細胞において機能的に重要な遺伝子≒体細胞の初期化を誘導する遺伝子」という仮説に基づき、ECATおよびES細胞の自己複製を支持する遺伝子(STAT3やβ-catenin等)を体細胞であるマウス胎仔線維芽細胞(MEF)に導入する実験を試みた。初期化因子候補としては計24の遺伝子が絞り込まれ、上述のFbx15遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたノックインマウスの細胞が利用された。このマウスの体細胞はECATであるFbx15を発現していないため、G418(ネオマイシン耐性遺伝子によって不活性化される抗生物質)を添加すると細胞は死滅する。一方、ES細胞等の多能性幹細胞はFbx15の発現と一致してネオマイシン耐性遺伝子を発現することから、G418に対して耐性となる。このシステムを用いて各候補遺伝子が1種類ずつ導入されたが、この場合にはG418耐性のES細胞様コロニーは観察されなかった。ところが、24種類全ての候補遺伝子を同時に導入した場合、ES細胞に類似したG418耐性細胞コロニーが出現することが明らかとなった。その後、24遺伝子から1遺伝子を差し引いた23遺伝子を導入する実験により、最終的にES細胞様コロニーの誘導には4種類の遺伝子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)の組合せで十分であることが判明した。得られた細胞はES細胞マーカー遺伝子を発現しているほか、胚葉体形成培養や皮下移植によるテラトーマ形成実験により三胚葉に分化する能力を有することが確認され、iPS細胞と名付けられた<ref name="ref1" />。また、iPS細胞を誘導する遺伝子セットは通称「山中4因子」とも呼ばれる。  
 続いて、山中博士らは「ES細胞において機能的に重要な遺伝子≒体細胞の初期化を誘導する遺伝子」という仮説に基づき、ECATおよびES細胞の自己複製を支持する遺伝子([[STAT3]]や[[β-catenin]]等)を体細胞であるマウス胎仔線維芽細胞(MEF)に導入する実験を試みた。初期化因子候補としては計24の遺伝子が絞り込まれ、上述のFbx15遺伝子座に[[wikipedia:JA:ネオマイシン|ネオマイシン]]耐性遺伝子が挿入されたノックインマウスの細胞が利用された。このマウスの体細胞はECATであるFbx15を発現していないため、[[wikipedia:G418|G418]](ネオマイシン耐性遺伝子によって不活性化される抗生物質)を添加すると細胞は死滅する。一方、ES細胞等の多能性幹細胞はFbx15の発現と一致してネオマイシン耐性遺伝子を発現することから、G418に対して耐性となる。このシステムを用いて各候補遺伝子が1種類ずつ導入されたが、この場合にはG418耐性のES細胞様コロニーは観察されなかった。ところが、24種類全ての候補遺伝子を同時に導入した場合、ES細胞に類似したG418耐性細胞コロニーが出現することが明らかとなった。その後、24遺伝子から1遺伝子を差し引いた23遺伝子を導入する実験により、最終的にES細胞様コロニーの誘導には4種類の遺伝子(Oct4、[[wikipedia:Sox2|Sox2]]、[[wikipedia:Klf4|Klf4]]、[[wikipedia:c-Myc|c-Myc]])の組合せで十分であることが判明した。得られた細胞はES細胞マーカー遺伝子を発現しているほか、胚葉体形成培養や皮下移植による[[wikipedia:JA:テラトーマ|テラトーマ]]形成実験により三胚葉に分化する能力を有することが確認され、iPS細胞と名付けられた<ref name="ref1" />。また、iPS細胞を誘導する遺伝子セットは通称「山中4因子」とも呼ばれる。  


=== 初期化レベルにみられる多様性  ===
=== 初期化レベルにみられる多様性  ===
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=== 細胞特性  ===
=== 細胞特性  ===


 iPS細胞の一般的な細胞特性として、ES細胞を規定する特性である自己複製能、分化多能性、造腫瘍性、活発な増殖能、不死性を備えている。後述の通り、培養下においてiPS細胞を様々な細胞系譜へと分化誘導することも可能である。多能性幹細胞が有する分化多能性を表す一つの基準として、ナイーブ状態(naive state)とプライムド状態(primed state)の区分がある。ナイーブ状態は胚盤胞の内部細胞塊の起源をより強く反映していると考えられ、マウスやラットのES細胞はこちらに分類される。形態的にはドーム状のコロニーを形成し、LIFとBMP4依存的に自己複製する。ナイーブ状態の中でも、非常に高いキメラ形成能および生殖系列への寄与を示す細胞はグラウンドステート(ground state)にあるとも表現される。一方、プライムド状態は胚盤胞より発生が進んだエピブラストの起源に相当すると考えられ、ウサギや霊長類のES細胞が含まれる。 自己複製にはFGF2とActivin Aを必要とし、扁平なコロニーを形成して増殖する。iPS細胞の多能性状態(ナイーブまたはプライムド)は基本的に同種のES細胞と相同であるが、これは種の相違によって規定されているものではなく、各々の細胞株として反映する発生段階の差に起因すると考えられる。
 iPS細胞の一般的な細胞特性として、ES細胞を規定する特性である自己複製能、分化多能性、造腫瘍性、活発な増殖能、不死性を備えている。後述の通り、培養下においてiPS細胞を様々な細胞系譜へと分化誘導することも可能である。多能性幹細胞が有する分化多能性を表す一つの基準として、ナイーブ状態(naive state)とプライムド状態(primed state)の区分がある。ナイーブ状態は胚盤胞の内部細胞塊の起源をより強く反映していると考えられ、[[wikipedia:JA:マウス|マウス]]や[[wikipedia:JA:ラット|ラット]]のES細胞はこちらに分類される。形態的にはドーム状のコロニーを形成し、[[wikipedia:LIF|LIF]]と[[wikipedia:BMP4|BMP4]]依存的に自己複製する。ナイーブ状態の中でも、非常に高いキメラ形成能および生殖系列への寄与を示す細胞はグラウンドステート(ground state)にあるとも表現される。一方、プライムド状態は胚盤胞より発生が進んだ[[wikipedia:JA:エピブラスト|エピブラスト]]の起源に相当すると考えられ、[[wikipedia:JA:ウサギ|ウサギ]]や[[wikipedia:JA:霊長類|霊長類]]のES細胞が含まれる。 自己複製には[[wikipedia:FGF2|FGF2]]と[[wikipedia:Activin A|Activin A]]を必要とし、扁平なコロニーを形成して増殖する。iPS細胞の多能性状態(ナイーブまたはプライムド)は基本的に同種のES細胞と相同であるが、これは種の相違によって規定されているものではなく、各々の細胞株として反映する発生段階の差に起因すると考えられる。


=== 利点  ===
=== 利点  ===


 iPS細胞に先んじてSCNTやES細胞培養が確立されていたにも関わらずヒトiPS細胞の作成が求められた背景には、ヒト初期胚の研究利用をとりまく様々な課題や制限の存在があった。まず、ヒトES細胞の樹立には「生命の萌芽」と位置付けられるヒト受精卵の破壊が伴うことから、倫理的な問題となっていた。また、細胞移植治療への応用を鑑みた際、ES細胞はレシピエントとは他人の細胞であることから、そのままでは免疫拒絶反応が惹起されてしまう。一方、SCNT研究の場面においては、ヒト卵の入手と使用に関わる数的・倫理的制限に加えて胚操作上の技術的困難が挙げられた。これに対し、体細胞起源であるiPS細胞はヒト胚の利用に関する倫理的問題には該当せず、細胞ソースの調達における数的制限もない。また、技術的にも非常に容易であることに加え、母体への侵襲や胚操作の実施が困難な動物種にも適用できる利点も大きい。さらに、基礎生物学的な観点からみると、特定の起源細胞と因子を出発点に体細胞初期化についてアプローチできることから、iPS細胞の誘導は初期化をもたらす分子機構を解明するための強力かつ簡便な実験系であるともいえる。
 iPS細胞に先んじて[[wikipedia:SCNT|SCNT]]やES細胞培養が確立されていたにも関わらずヒトiPS細胞の作成が求められた背景には、ヒト初期胚の研究利用をとりまく様々な課題や制限の存在があった。まず、ヒトES細胞の樹立には「生命の萌芽」と位置付けられるヒト受精卵の破壊が伴うことから、倫理的な問題となっていた。また、細胞移植治療への応用を鑑みた際、ES細胞はレシピエントとは他人の細胞であることから、そのままでは免疫拒絶反応が惹起されてしまう。一方、SCNT研究の場面においては、ヒト卵の入手と使用に関わる数的・倫理的制限に加えて胚操作上の技術的困難が挙げられた。これに対し、体細胞起源であるiPS細胞はヒト胚の利用に関する倫理的問題には該当せず、細胞ソースの調達における数的制限もない。また、技術的にも非常に容易であることに加え、母体への侵襲や胚操作の実施が困難な動物種にも適用できる利点も大きい。さらに、基礎生物学的な観点からみると、特定の起源細胞と因子を出発点に体細胞初期化についてアプローチできることから、iPS細胞の誘導は初期化をもたらす分子機構を解明するための強力かつ簡便な実験系であるともいえる。


== 樹立方法  ==
== 樹立方法  ==
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=== &nbsp;動物種  ===
=== &nbsp;動物種  ===


 マウスにおけるiPS細胞の樹立が報告された翌年、ヒトiPS細胞の樹立が報告された<ref name="ref2"><pubmed> 18035408 </pubmed></ref><ref name="ref3"><pubmed> 18029452 </pubmed></ref>。その後、ラット、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌのほか、非ヒト霊長類であるマーモセット、アカゲザル、カニクイザルにおいてもiPS細胞が樹立されている。また、絶滅危惧種であるシロサイやマンドリルのiPS細胞樹立の報告もあり、希少な遺伝子資源の保存といった観点からも注目されている。
 マウスにおけるiPS細胞の樹立が報告された翌年、ヒトiPS細胞の樹立が報告された<ref name="ref2"><pubmed> 18035408 </pubmed></ref><ref name="ref3"><pubmed> 18029452 </pubmed></ref>。その後、ラット、ウサギ、[[wikipedia:JA:ブタ|ブタ]]、[[wikipedia:JA:ウマ|ウマ]]、[[wikipedia:JA:ウシ|ウシ]]、[[wikipedia:JA:ヒツジ|ヒツジ]]、[[wikipedia:JA:イヌ|イヌ]]のほか、非ヒト霊長類である[[wikipedia:JA:マーモセット|マーモセット]]、[[wikipedia:JA:アカゲザル|アカゲザル]]、[[wikipedia:JA:カニクイザル|カニクイザル]]においてもiPS細胞が樹立されている。また、絶滅危惧種である[[wikipedia:JA:シロサイ|シロサイ]]や[[wikipedia:JA:マンドリル|マンドリル]]のiPS細胞樹立の報告もあり、希少な[[wikipedia:JA:遺伝子資源|遺伝子資源]]の保存といった観点からも注目されている。


=== 細胞種  ===
=== 細胞種  ===


 最初のマウスiPS細胞の樹立には胎仔の線維芽細胞および成体の尾線維芽細胞が、最初のヒトiPS細胞の樹立には胎児、新生児、成人の線維芽細胞が用いられた。その後、胃上皮細胞、肝実質細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、色素細胞、血管内皮細胞、血液細胞、羊膜細胞、神経幹細胞、歯髄幹細胞、脂肪幹細胞、間葉系幹細胞等、多様な細胞種からの樹立が相次いで報告されている。
 最初のマウスiPS細胞の樹立には胎仔の線維芽細胞および成体の尾線維芽細胞が、最初のヒトiPS細胞の樹立には胎児、新生児、成人の線維芽細胞が用いられた。その後、[[wikipedia:JA:胃|胃]]上皮細胞、[[wikipedia:JA:肝実質細胞|肝実質細胞]]、[[wikipedia:JA:ケラチノサイト|ケラチノサイト]]、[[wikipedia:JA:毛乳頭|毛乳頭]]細胞、[[wikipedia:JA:色素細胞|色素細胞]]、[[wikipedia:JA:血管内皮|血管内皮]]細胞、血液細胞、[[wikipedia:JA:羊膜|羊膜]]細胞、[[神経幹細胞]]、[[wikipedia:JA:歯髄|歯髄]]幹細胞、[[wikipedia:JA:脂肪幹細胞|脂肪幹細胞]]、[[wikipedia:JA:間葉系幹細胞|間葉系幹細胞]]等、多様な細胞種からの樹立が相次いで報告されている。


=== 遺伝子導入方法  ===
=== 遺伝子導入方法  ===


 当初、遺伝子導入のベクターとしてレトロウイルスやレンチウイルスが利用された。しかし、どちらのウイルスも導入細胞のゲノムDNAに組み込まれることから、挿入変異や近傍の遺伝子の発現に及ぼす影響等、予期しない異常が生じる危険性を包含している。また、レトロウイルスベクターは通常、多能性幹細胞において強力な発現抑制(サイレンシング)を受けるが、初期化レベルが低いiPS細胞では発現が持続していることや分化後も導入遺伝子の活性化が起こりうることから、細胞移植への応用には腫瘍形成といったリスクが伴う。そこで、iPS細胞樹立後に導入遺伝子を除去する手法として、Cre-loxPシステムの利用やトランスポゾンの特性を利用したピギーバック(piggyBac)が開発された。一方、そもそもゲノムに組み込まれないベクターとして、アデノウイルスやセンダイウイルス、プラスミドDNAを用いた誘導法も利用されている。さらに、ベクターを介さずに直接、組換えタンパク質や合成RNA、miRNAを導入するiPS細胞の作成についても報告がなされている。
 当初、遺伝子導入の[[wikipedia:JA:ベクター|ベクター]]として[[wikipedia:JA:レトロウイルス|レトロウイルス]]や[[wikipedia:JA:レンチウイルス|レンチウイルス]]が利用された。しかし、どちらのウイルスも導入細胞の[[wikipedia:JA:ゲノム|ゲノム]]DNAに組み込まれることから、挿入変異や近傍の遺伝子の発現に及ぼす影響等、予期しない異常が生じる危険性を包含している。また、レトロウイルスベクターは通常、多能性幹細胞において強力な発現抑制(サイレンシング)を受けるが、初期化レベルが低いiPS細胞では発現が持続していることや分化後も導入遺伝子の活性化が起こりうることから、細胞移植への応用には腫瘍形成といったリスクが伴う。そこで、iPS細胞樹立後に導入遺伝子を除去する手法として、[[wikipedia:Cre-lox|Cre-lox]]Pシステムの利用や[[wikipedia:JA:トランスポゾン|トランスポゾン]]の特性を利用したピギーバック(piggyBac)が開発された。一方、そもそもゲノムに組み込まれないベクターとして、[[wikipedia:JA:アデノウイルス|アデノウイルス]]や[[wikipedia:JA:センダイウイルス|センダイウイルス]]、[[wikipedia:JA:プラスミド|プラスミド]]DNAを用いた誘導法も利用されている。さらに、ベクターを介さずに直接、組換えタンパク質や合成RNA、[[wikipedia:miRNA|miRNA]]を導入するiPS細胞の作成についても報告がなされている。


=== 誘導因子  ===
=== 誘導因子  ===


 前述の通り、最初のiPS細胞はOct4、Sox2、Klf4、c-Mycの4種類の遺伝子(山中4因子)を導入することによって作成されたが、間もなく、誘導効率は低下するもののc-Mycを除いたOct4、Sox2、Klf4のみ(山中3因子)によってもiPS細胞が樹立できることが示された。ヒトの場合もマウスと同じ遺伝子セットでiPS細胞の誘導が可能であるが<ref name="ref2" />、山中博士らとほぼ同時にヒトiPS細胞について報告したJames Thomson博士らはOCT4、SOX2、NANOG、LIN28の組合せを用いている<ref name="ref3" />。最も広く用いられている遺伝子セットはプロトタイプである山中4因子であるが、神経幹細胞の場合はOct4単独の導入によってもiPS細胞が誘導しうるように、細胞種によっては少ない因子・異なる組合せでのiPS細胞誘導も可能である。また、iPS細胞の誘導効率や初期化レベルを向上させる要素として、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、L-Myc、Glis1やmiRNA-290クラスター等の導入、およびInk4/Arf、p53、p21、Baxの抑制等が報告されている。一方、低分子化合物を併用したiPS細胞誘導についても多数の報告がある。ES細胞の自己複製を亢進・維持する化合物としてFGF受容体阻害剤(SU5402)、MEK阻害剤(PD1843352またはPD0325901)、GSK3阻害剤(CHIR99021)が知られており、3種の混合は「3i」、後者2種の混合は「2i」と俗称される。これらの阻害剤やTGFβ受容体阻害剤(SB431542やA83-01)を添加することによって、iPS細胞の誘導効率の向上や選択が容易になるという報告例が示されている。また、エピジェネティック変化を促す化合物であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(バルプロ酸や酪酸)、G9a阻害剤(BIX01294)、DNAメチル化阻害剤(5-アザシチジンやRG108)等がiPS細胞誘導を促進することも報告されている。
 前述の通り、最初のiPS細胞はOct4、Sox2、Klf4、c-Mycの4種類の遺伝子(山中4因子)を導入することによって作成されたが、間もなく、誘導効率は低下するもののc-Mycを除いたOct4、Sox2、Klf4のみ(山中3因子)によってもiPS細胞が樹立できることが示された。ヒトの場合もマウスと同じ遺伝子セットでiPS細胞の誘導が可能であるが<ref name="ref2" />、山中博士らとほぼ同時にヒトiPS細胞について報告したJames Thomson博士らはOCT4、SOX2、NANOG、[[wikipedia:LIN28|LIN28]]の組合せを用いている<ref name="ref3" />。最も広く用いられている遺伝子セットはプロトタイプである山中4因子であるが、神経幹細胞の場合はOct4単独の導入によってもiPS細胞が誘導しうるように、細胞種によっては少ない因子・異なる組合せでのiPS細胞誘導も可能である。また、iPS細胞の誘導効率や初期化レベルを向上させる要素として、[[wikipedia:Esrrb|Esrrb]]、[[wikipedia:Nr5|Nr5]]a2、[[wikipedia:Tbx|Tbx]]3、[[wikipedia:L-Myc|L-Myc]]、[[wikipedia:Glis1|Glis1]]や[[wikipedia:miRNA-290|miRNA-290]]クラスター等の導入、および[[wikipedia:Ink4|Ink4]]/Arf、[[wikipedia:p53|p53]]、[[wikipedia:p21|p21]]、[[wikipedia:Bax|Bax]]の抑制等が報告されている。一方、低分子化合物を併用したiPS細胞誘導についても多数の報告がある。ES細胞の自己複製を亢進・維持する化合物として[[wikipedia:JA:FGF受容体|FGF受容体]]阻害剤(SU5402)、[[wikipedia:MEK|MEK]]阻害剤(PD1843352またはPD0325901)、[[wikipedia:GSK3|GSK3]]阻害剤(CHIR99021)が知られており、3種の混合は「3i」、後者2種の混合は「2i」と俗称される。これらの阻害剤や[[wikipedia:TGFβ|TGFβ]]受容体阻害剤(SB431542やA83-01)を添加することによって、iPS細胞の誘導効率の向上や選択が容易になるという報告例が示されている。また、エピジェネティック変化を促す化合物である[[wikipedia:JA:ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤]]([[wikipedia:JA:バルプロ酸|バルプロ酸]]や[[wikipedia:JA:酪酸|酪酸]])、[[wikipedia:JA:G9a阻害剤|G9a阻害剤]](BIX01294)、[[wikipedia:JA:DNAメチル化|DNAメチル化]]阻害剤([[wikipedia:JA:5-アザシチジン|JA:5-アザシチジン]]や[[wikipedia:RG108|RG108]])等がiPS細胞誘導を促進することも報告されている。


== 特定の細胞系譜への分化誘導  ==
== 特定の細胞系譜への分化誘導  ==

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