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==概要== | == 概要 == | ||
Tet on/offシステムとは抗生物質テトラサイクリン誘導体であるドキシサイクリンを投与することで細胞あるいは動物個体において可逆的に目的遺伝子の発現を調節できる実験系である。 このシステムは大腸菌テトラサイクリン耐性オペロンで働くTetリプレッサー（TetR）とTetオペレーター配列(tetO配列)を利用し、TetRはテトラサイクリン非存在下でtetO配列に結合するが、テトラサイクリンが結合するとtetO配列に結合できなくなるという性質を利用している。 ドキシサイクリン存在下で目的遺伝子を発現するものをTet-Onシステム、逆にドキシサイクリン非存在下で目的遺伝子が発現し、ドキシサイクリン存在下では発現が抑制されるものをTet-Offシステムと呼ぶ。 | |||
== 1. 基本原理 == | |||
=== | === tTA: tetracycline transactivator === | ||
TetRとヘルペスウイルス由来のVP16転写活性ドメイン (VP16AD)との融合タンパク質でありtetO配列に結合すると下流のプロモーターを活性化する。ドキシサイクリンと結合するとTetRがtetO配列に結合できなくなるためtetO 配列下流のプロモーターは活性化しない。 | |||
== | === reverse tTA: reverse tetracycline transactivator === | ||
TetR のアミノ酸残基を一部改変して作製されたreverse TetR（rTetR）とVP16ADとの融合タンパク質である。tTAとは逆にドキシサイクリンと結合することでtetO配列に結合し、下流のプロモーターを活性化する。 | |||
== | === TRE (Tetracycline Respons Element) === | ||
大腸菌のtetO配列の繰り返し配列から成りtTAあるいはrtTAが結合すると下流のプロモーターを活性化する。 | |||
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== 2. Tet-onシステムの原理 == | |||
目的の遺伝子を発現する組織、細胞に適したプロモーターの制御下でrtTAを発現する制御ベクター (Regular vector)、およびTRE配列をもつ最小プロモーター (Minimal Promoter)の下流に目的遺伝子をつなげた応答ベクター (Response vector)の両者を細胞あるいは動物個体に導入する。 発現したrtTAはドキシサイクリン非存在下 (Dox-)ではTREに結合しないが、ドキシサイクリンの培地への添加あるいは動物個体への投与 (Dox+)によりTREと結合するようになり、目的の遺伝子を発現するようになる。また、この発現制御はドキシサイクリン濃度依存的であるためドキシサイクリンの量で発現量を調節することが出来る。 | |||
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== 3. Tet-offシステムの原理 == | |||
細胞あるいは動物個体に導入するベクターのうち、制御ベクターが発現する遺伝子がtTAであることがTet-onシステムとの違いである。発現したtTAはrtTAとは逆にドキシサイクリン存在下 (Dox+)ではTREに結合しないが、ドキシサイクリンの培地からの除去あるいは動物個体への投与中止(Dox-)によりTREと結合するようになり、目的の遺伝子を発現するようになる。また、この発現制御はTet-onシステムと同様にドキシサイクリンの量で発現量を調節することが出来る。 | |||
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== 4. システム使用上の注意点 == | |||
テトラサイクリンより誘導体ドキシサイクリンの方がより強い転写誘導活性を示すため発現調節にはドキシサイクリンが用いられる。特にTet-Onシステムの場合、rtTAとテトラサイクリンとの結合が弱いため、必ずドキシサイクリンを使用する必要がある。また、Tet-onシステムはTet-offシステムに比して厳密な遺伝子調節が制御しにくい傾向がある。 | テトラサイクリンより誘導体ドキシサイクリンの方がより強い転写誘導活性を示すため発現調節にはドキシサイクリンが用いられる。特にTet-Onシステムの場合、rtTAとテトラサイクリンとの結合が弱いため、必ずドキシサイクリンを使用する必要がある。また、Tet-onシステムはTet-offシステムに比して厳密な遺伝子調節が制御しにくい傾向がある。 | ||