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==原理== | ==原理== | ||
高速液体クロマトグラフィーとは、物質が固定相（カラムの担体）とこれに接して流れる移動相（液体）との親和力の違いから一定の比率で分布し、その比率が物質によって異なる事を利用して分離する方法である。現在では、物質の精製や分析には欠かせない存在となっている。高速液体クロマトグラフィーには、イオン交換、逆相、順相、サイズ排除(ゲル濾過)、アフィニティーなど様々な方法がある。 | 高速液体クロマトグラフィーとは、物質が固定相（カラムの担体）とこれに接して流れる移動相（液体）との親和力の違いから一定の比率で分布し、その比率が物質によって異なる事を利用して分離する方法である。現在では、物質の精製や分析には欠かせない存在となっている。高速液体クロマトグラフィーには、イオン交換、逆相、順相、サイズ排除(ゲル濾過)、アフィニティーなど様々な方法がある。 | ||
===高速液体クロマトグラフィーの基本構成=== | ===高速液体クロマトグラフィーの基本構成=== | ||
移動相として溶媒や緩衝溶液を送るポンプ、試料を注入するインジェクター（試料導入部）、物質を分離するためのカラム、検出器、データ処理装置（PC）から構成されている(図1-A)。 | 移動相として溶媒や緩衝溶液を送るポンプ、試料を注入するインジェクター（試料導入部）、物質を分離するためのカラム、検出器、データ処理装置（PC）から構成されている(図1-A)。 | ||
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#データ処理ソフトウェア | #データ処理ソフトウェア | ||
#:検出されたデータを取得し、そこからピークの検出・解析をおこなう。各HPLCメーカーから装置の制御機能を合わせ持った製品が出されている。様々なメーカーの装置と接続可能な汎用ソフトウェアには、 EZChrom (Agilent)、 Empower (Waters)、 PowerChrom (eDAQ Pty Ltd)、 Unicorn（GE）などがある。 | #:検出されたデータを取得し、そこからピークの検出・解析をおこなう。各HPLCメーカーから装置の制御機能を合わせ持った製品が出されている。様々なメーカーの装置と接続可能な汎用ソフトウェアには、 EZChrom (Agilent)、 Empower (Waters)、 PowerChrom (eDAQ Pty Ltd)、 Unicorn（GE）などがある。 | ||
===測定方法=== | ===測定方法=== | ||
#プレカラム法とポストカラム法 | |||
#:HPLCで目的の物質がそのまま分析できない場合、感度を上げるために誘導化を行うことが多い。その誘導化の方法には、プレカラム法（図1-B）と ポストカラム法（図1-C）がある。プレカラム法は成分を分離する前に誘導化する方法であり、ポストカラム法はカラムで成分を分離してから誘導化する方法である。一般に感度を上げるためにプレカラム法で蛍光誘導化が行われる事が多い。蛍光誘導化（ラベル化）とは、蛍光を発しない物質を化学反応で蛍光を発する物質に変換すること、蛍光物質を化学的に結合させることである。測定する物質の種類にもよるが蛍光誘導化するとfmol~pmolまで測定可能になる。ポストカラム法では、分離後誘導化試薬と反応するため別途ポンプが必要となる。また、反応させるための反応コイルや反応カラムを使用することによってサンプルが拡散するため、ポストカラム法はプレカラム法に比べ特に溶出時間が遅くなり物質の感度が悪くなることがある。 | |||
#アイソクラティック法とグラジエント法 | |||
#:目的物質を移動相の溶媒の性質を変えて分離条件良く分析する方法には、アイソクラティック （Isocratic）法とグラジエント（Gradient）法がある。アイソクラティック法では単一な移動相を用いシンプルな装置で分析する。移動相の組成は複雑で、緩衝溶液のほかに有機溶媒やイオンペア試薬の添加をすることが多い。一方のグラジエント法は、２種類以上の移動相を用いるためHPLCシステムが少々複雑になる。一般的には移動相として水系の緩衝溶液と有機溶媒の２つを用い、徐々に濃度勾配をつけて分離を行う。この方法で良い分離が得られない場合は、移動相の濃度をステップワイズに変えたり、これと直線的に変える方法を組み合わせるとよい。 | |||
#イオンペア試薬 | |||
#:イオンペア試薬は、陽イオンと陰イオンの２種類ある。目的の物質が正に電荷して陽イオン（＋）の場合はアルキルスルホン酸塩を、負に電荷して陰イオン（−）の場合は第４級アンモニウム塩を用いる。イオン性物質のサンプルは、イオンペア試薬とイオン結合して電気的に中性となり、さらにイオンペア試薬のアルキル鎖により逆相カラムに保持されて分離できるようになる。数種類のアルキル鎖の長さが異なる試薬があり、分離の度合いを見て選択する。 | |||
イオンペア試薬は、陽イオンと陰イオンの２種類ある。目的の物質が正に電荷して陽イオン（＋）の場合はアルキルスルホン酸塩を、負に電荷して陰イオン（−）の場合は第４級アンモニウム塩を用いる。イオン性物質のサンプルは、イオンペア試薬とイオン結合して電気的に中性となり、さらにイオンペア試薬のアルキル鎖により逆相カラムに保持されて分離できるようになる。数種類のアルキル鎖の長さが異なる試薬があり、分離の度合いを見て選択する。 | HPLCの分析では、検出器の選択、カラムの選択、高感度にするための誘導化、移動相の種類、分離条件(２つの移動相の割合を変えて分離する)、などを組み合わせて目的物質の分析法を確立する。 | ||
===応用例（スイッチングバルブ法）=== | ===応用例（スイッチングバルブ法）=== | ||
これまでHPLCの一般的な装置構成について述べてきた。ここでは、装置構成の応用例としてスイッチングバルブ装置を用いたHPLCのシステムについて述べる。 | |||
図2-AのHPLCシステムではアイソクラティック法にスイッチングバルブ装置を組んでいる（構成：移動相２液、ポンプ２台、スイッチングバルブ１台、トラップカラム１本、分離用カラム２本、検出器２台）。スイッチングバルブとは、特定な時間を設定してその時間になると流路を切り替えることができる装置のことである。トラップカラムは、サンプル内の物質を一時的に保持するための長さが短いカラム（１cm程度）である。インジェクション前の流路は、移動相AはポンプA → インジェクター → トラップカラム → カラムA → 検出器Aへ流れている。このとき移動相Bは、ポンプB → カラムB → 検出器Bを流れており、トラップカラムには流れない。インジェクション後スイッチングバルブ設定時間にバルブが作動するとトラップカラムに移動相Bが流れる。このシステムで重要な点は、スイッチングバルブ設定時間である。設定時間を調節することによりカラムBで検出する物質の溶出時間を変えることができる。また目的物質の溶出が移動相の変わり目になると正確な分析ができなくなるため注意が必要である。溶出時間の速いものと遅いものを同時に分析したい場合、スイッチングバルブ法は１本のカラムで分析する場合と比較し約半分の時間でかつ溶出時間の遅い物質を感度良く分析できる利点がある。 | 図2-AのHPLCシステムではアイソクラティック法にスイッチングバルブ装置を組んでいる（構成：移動相２液、ポンプ２台、スイッチングバルブ１台、トラップカラム１本、分離用カラム２本、検出器２台）。スイッチングバルブとは、特定な時間を設定してその時間になると流路を切り替えることができる装置のことである。トラップカラムは、サンプル内の物質を一時的に保持するための長さが短いカラム（１cm程度）である。インジェクション前の流路は、移動相AはポンプA → インジェクター → トラップカラム → カラムA → 検出器Aへ流れている。このとき移動相Bは、ポンプB → カラムB → 検出器Bを流れており、トラップカラムには流れない。インジェクション後スイッチングバルブ設定時間にバルブが作動するとトラップカラムに移動相Bが流れる。このシステムで重要な点は、スイッチングバルブ設定時間である。設定時間を調節することによりカラムBで検出する物質の溶出時間を変えることができる。また目的物質の溶出が移動相の変わり目になると正確な分析ができなくなるため注意が必要である。溶出時間の速いものと遅いものを同時に分析したい場合、スイッチングバルブ法は１本のカラムで分析する場合と比較し約半分の時間でかつ溶出時間の遅い物質を感度良く分析できる利点がある。 | ||
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試料の前処理は、測定例（1）と同様に行い、上清を1200倍に希釈して15 μLをHPLCサンプルにした。 | 試料の前処理は、測定例（1）と同様に行い、上清を1200倍に希釈して15 μLをHPLCサンプルにした。 | ||
蛍光誘導化のため、オートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル10 μLをインジェクションした。 | 蛍光誘導化のため、オートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μL、サンプル15 μLを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル10 μLをインジェクションした。 | ||
===神経伝達モノアミンとその代謝物、およびアセチルコリンの分析（電気化学検出法）=== | ===神経伝達モノアミンとその代謝物、およびアセチルコリンの分析（電気化学検出法）=== | ||
====電気化学検出の原理==== | ====電気化学検出の原理==== | ||