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英：High Performance Liquid Chromatography、英略語：HPLC | 英：High Performance Liquid Chromatography、英略語：HPLC | ||
高速液体クロマトグラフィーとは、物質が固定相（カラムの担体）とこれに接して流れる移動相（液体）との親和力の違いから一定の比率で分布し、その比率が物質によって異なる事を利用して分離する方法である。移動相を高圧で流すことで高い分離および感度を得ることができ、固定相、移動相、検出器の組み合わせにより様々な物質の分析を行うことが可能である。神経科学分野においても各種神経伝達物質やタンパク質、ペプチドの分析など、幅広く利用されている<ref name=ref1> 入江 照四、高速液体クロマトグラフ、科学機器入門［増補改訂版］、東京科学機器協会：2010，180-181</ref>。 | |||
[[ファイル:HPLC 図1.jpg|thumb|300px|right|図1. (A) HPLCの基本フローチャート. (B) プレカラム法の基本フローチャート. (C) ポストカラム法の基本フローチャート.]] | [[ファイル:HPLC 図1.jpg|thumb|300px|right|図1. (A) HPLCの基本フローチャート. (B) プレカラム法の基本フローチャート. (C) ポストカラム法の基本フローチャート.]] | ||
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===神経伝達モノアミンとその代謝物、およびアセチルコリンの分析（電気化学検出法）=== | ===神経伝達モノアミンとその代謝物、およびアセチルコリンの分析（電気化学検出法）=== | ||
#電気化学検出の原理 | #電気化学検出の原理 | ||
#: 酸化還元活性を有する物質を高感度に検出する方法である。一定の電位を印加した電極上で物質が酸化又は還元された時に流れる電流を検出する。電流量は濃度に比例する為、定量分析が可能である。検出器には、電流測定検出器 (Amperometric detector) と電量検出器(Coulometric detector) | #: 酸化還元活性を有する物質を高感度に検出する方法である。一定の電位を印加した電極上で物質が酸化又は還元された時に流れる電流を検出する。電流量は濃度に比例する為、定量分析が可能である。検出器には、電流測定検出器 (Amperometric detector) と電量検出器(Coulometric detector) の2種類があり、一般的にHPLCにおいては電流測定検出器を用いることが多い。これは、電量検出器に比べて電解効率が大幅に低いものの、良いシグナルノイズ比・感度が得られるためである。検出セルは作用電極、参照電極、対極電極からなり、作用電極は測定対象に応じてグラッシーカーボン、グラファイト、白金などを使用する。電気化学検出は1950年代にKemuraによって最初にクロマトグラフィーの検出法として用いられ、1960年代後半から1970年代前半にかけてAdamsらによりカテコールアミンおよびアスコルビン酸の分析に応用された。それからさらなる改良が重ねられ、現在神経伝達物質およびその代謝物の定量方法として、一般的な技術となっている。詳細な測定原理や方法については、Meffordによる総説<ref name=ref2><pubmed>6163932</pubmed></ref>やZapataらのプロトコル<ref name=ref3><pubmed>19575473</pubmed></ref>等が参考となる。 | ||
#アセチルコリンおよびコリンの分析 | #アセチルコリンおよびコリンの分析 | ||
#: アセチルコリンのHPLC-ECDを用いた分析は、1983年にPotterらによって最初に報告された。アセチルコリンは電気化学的に不活性である為、分離用の本カラムの下流にアセチルコリンエステラーゼ (AChE)および コリンオキシダーゼ (ChO) を固定化した酵素カラムを配置し、オンラインで加水分解・酸化することで生成した過酸化水素を白金電極にて検出する (印加電圧 +450 mV vs Ag/AgCl) 。陽イオン交換カラムとともに、移動相にリン酸バッファーを用いることで、アセチルコリンとコリンの分離、そして短時間分析の両立が可能である。 | #: アセチルコリンのHPLC-ECDを用いた分析は、1983年にPotterらによって最初に報告された。アセチルコリンは電気化学的に不活性である為、分離用の本カラムの下流にアセチルコリンエステラーゼ (AChE)および コリンオキシダーゼ (ChO) を固定化した酵素カラムを配置し、オンラインで加水分解・酸化することで生成した過酸化水素を白金電極にて検出する (印加電圧 +450 mV vs Ag/AgCl) 。陽イオン交換カラムとともに、移動相にリン酸バッファーを用いることで、アセチルコリンとコリンの分離、そして短時間分析の両立が可能である。 | ||
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本稿で紹介したHPLC検出はごく一部であるが、HPLC分析を行うにあたり、測定対象の物性を理解した上で、それに応じた分析条件、検出器を用いることが重要である。 | 本稿で紹介したHPLC検出はごく一部であるが、HPLC分析を行うにあたり、測定対象の物性を理解した上で、それに応じた分析条件、検出器を用いることが重要である。 | ||
==参考文献== | |||
<references /> | |||
（執筆者：森下泰全、大月香、俣賀宣子 担当編集委員：河西春朗） | （執筆者：森下泰全、大月香、俣賀宣子 担当編集委員：河西春朗） | ||