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== FM1-43とは == | == FM1-43とは == | ||
[[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|''' | [[Image:Takahashinoriko fig 1.jpg|thumb|250px|'''図1. FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識'''<br>FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。]] Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、[[細胞膜]]を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。[[シナプス前終末]]の機能解析や、[[分泌小胞]]の動態解析に広く用いられる。 | ||
色素の特性として次の3つの性質がある。 | 色素の特性として次の3つの性質がある。 | ||
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== 分子構造 == | == 分子構造 == | ||
[[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|''' | [[Image:Takahashinoriko fig 2.jpg|thumb|250px|'''図2. FM 色素群の分子構造'''<br>二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する。]] 構造は、[[wikipedia:ja:親水性|親水性]]領域、[[wikipedia:ja:二重結合|二重結合]]領域、[[wikipedia:ja:疎水性|疎水性]]炭素鎖領域に分けられる。 | ||
親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 | 親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。 | ||
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== 応用例 == | == 応用例 == | ||
==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ==== | ==== シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定 ==== | ||
[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|''' | [[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3. 開口放出に伴う FM 蛍光の変化'''<br>膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる。]] | ||
シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、[[活性帯]] ([[active zone]])にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を[[即時性放出プール]] ([[readily releasable pool]], [[RRP]]）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後 30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。これを[[リサイクリング]]と呼び、これに関係する小胞の全体を[[リサイクリングプール]] ([[recycling pool]])、又は[[放出可能プール]] (total recycling pool, TRP)という。 | |||
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え、[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染め出し、その後色素を含まない溶液で細胞外を還流し、外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうど RRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて wash outをすると RRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPは TRPの 10-30%程度と推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40個程度の小さなシナプスでは RRPの小胞数は 4-12個となる。 | 細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 20 Hz、900 発）を与え、[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染め出し、その後色素を含まない溶液で細胞外を還流し、外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうど RRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて wash outをすると RRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPは TRPの 10-30%程度と推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRPが40個程度の小さなシナプスでは RRPの小胞数は 4-12個となる。 | ||
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==== シナプス小胞の動態の解析 ==== | ==== シナプス小胞の動態の解析 ==== | ||
開口放出した顆粒はactive zoneの周辺から内部に取り込まれ（[[エンドサイトーシス]]）、再び放出可能となる（[[リサイクル]]）。このリサイクルにかかる時間は、[[海馬]]培養標本では 20-30秒、[[神経筋接合部]]では 60秒と見積もられた。TRPを FM1-43で染めた後、DABを光変換して電顕で見ると染色された小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部）への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された<ref><pubmed> 1553547 </pubmed></ref> 。 | |||
=== 膜融合様式の解析 === | === 膜融合様式の解析 === | ||
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FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 | FM1-43を[[網膜]][[双極性細胞]]のシナプス小胞に取り込ませて標識し、[[全反射顕微鏡]]で細胞膜直下（～100nm）の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された<ref><pubmed> 10972279 </pubmed></ref> 。 | ||
また、[[下垂体]][[前葉細胞]] (lactotrophs) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 | また、[[下垂体]][[前葉細胞]] ([[lactotrophs]]) や[[wikipedia:ja:膵島|膵島]]細胞においても、[[ホルモン]]を含む大型[[有芯小胞]]の[[膜融合]]に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された <ref><pubmed> 10953007 </pubmed></ref><ref><pubmed>12193788 </pubmed></ref>。 | ||
=== 分泌小胞の直径測定 === | === 分泌小胞の直径測定 === | ||
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シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 | シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である <ref><pubmed> 16150799 </pubmed></ref>。 | ||
水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）と FM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[ | 水溶性色素（赤色[[wikipedia:ja:スルホローダミンB|スルホローダミンB]], SRB）と FM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 [[2光子レーザー走査顕微鏡]]で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される（直径＝6 ΔSRB/ΔFM1-43）。本法は色素濃度やレンズ特性（[[wikipedia:ja:点拡がり関数|点拡がり関数]]）によらず、シナプス小胞のような光学[[wikipedia:ja:解像度|解像度]]以下の器官の計測にも応用可能である。 | ||
== 関連項目 == | == 関連項目 == | ||
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*[[膜融合]] | *[[膜融合]] | ||
*[[シナプス]] | *[[シナプス]] | ||
*[[ | *[[分泌]] | ||
== 参考文献 == | == 参考文献 == | ||
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<references /> | <references /> | ||
（執筆者：高橋倫子、河西春郎 担当編集委員：柚崎通介） | |||