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<font size="+1">森下 泰全、大月 香、[http://researchmap.jp/bma_ul 俣賀宣子]</font><br> | |||
''独立行政法人理化学研究所 脳科学総合研究センター''<br> | |||
DOI：<selfdoi /> 原稿受付日：2012年5月21日 原稿完成日：2012年6月6日<br> | |||
担当編集委員：[http://researchmap.jp/haruokasai 河西 春郎]（東京大学 大学院医学系研究科）<br> | |||
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英：High Performance Liquid Chromatography 英略語：HPLC 独：Hochleistungsflüssigkeitschromatografie 仏：chromatographie liquide haute performance | 英：High Performance Liquid Chromatography 英略語：HPLC 独：Hochleistungsflüssigkeitschromatografie 仏：chromatographie liquide haute performance | ||
高速液体クロマトグラフィーとは、物質が固定相（[[wikipedia:JA:カラムクロマトグラフィー|カラム]] | {{box|text= | ||
高速液体クロマトグラフィーとは、物質が固定相（[[wikipedia:JA:カラムクロマトグラフィー|カラム]]）とこれに接して流れる移動相（液体）との親和力の違いから一定の比率で分布し、その比率が物質によって異なる事を利用して分離する方法である。移動相を高圧で流すことで高い分離および感度を得ることができ、固定相、移動相、検出器の組み合わせにより様々な物質の分析を行うことが可能である。脳科学分野においても各種[[神経伝達物質]]や[[wikipedia:JA:タンパク質|タンパク質]]、[[wikipedia:JA:ペプチド|ペプチド]]の分析など、幅広く利用されている。 | |||
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==高速液体クロマトグラフィー== | |||
高速液体クロマトグラフィーは、古くから脳内のタンパク質の精製・分取、神経伝達物質やペプチドの分析など多岐にわたり用いられてきた手法である。なぜなら、固定相(カラム)と移動相（溶媒、緩衝液など）を適切に選択することにより、目的物質を妨害なく分離し、分取・分析できるからである。カラムの種類は豊富で、疎水性相互作用やイオン性結合など分子間相互作用を利用するものが多く、目的物質の性質を考えて選択する必要がある。一方、溶媒や緩衝溶液は目的物質のカラムに対する親和力の強弱を調節する重要な役割を持つ。そこで、目的物質をカラムからほどよい時間に溶出するように移動相の組成を決めるところに工夫や経験が必要である。このように高速液体クロマトグラフは、最適なカラムと移動相を組み合わせることにより類似物質においても高い分離を達成できる装置である。そこで本稿では主に脳科学分野で神経伝達物質の分析に必要な装置（高速液体クロマトグラフ）の基本構成とグルタミン酸を始めとするアミノ酸の分析、[[モノアミン]]とその代謝物の一斉分析などに焦点を絞り解説する。 | |||
==原理== | ==原理== | ||
高速液体クロマトグラフィーとは、物質が固定相（カラム）とこれに接して流れる移動相（液体）との親和力の違いから一定の比率で分布し、その比率が物質によって異なる事を利用して分離する方法である。現在では、物質の精製や分析には欠かせない存在となっている。高速液体クロマトグラフィーには、[[wikipedia:JA:イオン交換|イオン交換]]、[[wikipedia:Reversed-phase chromatography|逆相]]、[[wikipedia:High-performance_liquid_chromatography#Normal-phase_chromatography|順相]]、[[wikipedia:High-performance_liquid_chromatography#Size-exclusion_chromatography|サイズ排除]]([[ゲル濾過]])、[[wikipedia:JA:アフィニティークロマトグラフィー|アフィニティー]]など様々な方法がある<ref name=ref1> '''入江 照四''' <br />高速液体クロマトグラフ 科学機器入門[増補改訂版]<br />''東京科学機器協会'', 2010, 180-181</ref>。 | |||
===高速液体クロマトグラフィーの基本構成=== | ===高速液体クロマトグラフィーの基本構成=== | ||
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====ポンプ==== | ====ポンプ==== | ||
移動相の制御に欠かせない装置である。メーカーによって多少異なる形をしているが基本的な構造は同じである。1台のポンプで1つの移動相が基本であるが(図1-A)、2つの電磁弁が付属していると2つの移動相を制御することができる(図1-B,C)。高速アミノ酸分析計（HITACHI）では電磁弁が5つ付属しており、1台のポンプで5種類の移動相を切り替えて1分析で約40種類のアミノ酸を定量することができる。電磁弁以外では、リザーバ−切り替えバルブがあり同様に6種類の移動相を変えることが可能である。 | |||
====インジェクター==== | ====インジェクター==== | ||
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====カラム==== | ====カラム==== | ||
現在では一般的に担体を充填したものをカラムと呼び、担体にはシリカゲル、アルミナ、多孔質ポリマーなどが用いられる。カラムの種類には、主にイオン交換、逆相、順相、サイズ排除（ゲル濾過）そして[[wikipedia:JA:光学異性体|光学異性体]]分離カラムあり、分析する物質の性質を考慮して選択しなければならない。 | |||
=====イオン交換カラム===== | =====イオン交換カラム===== | ||
: | : イオン性結合を用いたイオン交換カラムには、[[wikipedia:JA:陽イオン|陽イオン]]、[[wikipedia:JA:陰イオン|陰イオン]]、両イオン型の3つのタイプがある。これらは、[[wikipedia:JA:金属|金属]]イオン、[[wikipedia:JA:無機酸|無機酸]]、[[wikipedia:JA:アミノ酸|アミノ酸]]、[[wikipedia:JA:ペプチド|ペプチド]]やタンパク質の分析・分取に用いられる。 | ||
=====逆相カラム===== | =====逆相カラム===== | ||
: | |||
: 疎水性相互作用を用いた逆相カラムは、最も種類が多く様々なカラムが開発されている。特に低分子の分析に用いられることが多く神経伝達物質、誘導化したアミノ酸、医薬品、[[wikipedia:JA:ホルモン|ホルモン]]、ペプチドの分析などに用いられている。 | |||
=====順相カラム===== | =====順相カラム===== | ||
: 順相カラムは、有機合成した化合物の分離に多く用いられる。 | : 順相カラムは、有機合成した化合物の分離に多く用いられる。 | ||
=====サイズ排除カラム===== | =====サイズ排除カラム===== | ||
: | |||
: 分子ふるいを用いたサイズ排除カラムは、タンパク質を分子量ごとに分画または会合体としてモノマー、ダイマー、トリマーの分析・分取に用いられる。 | |||
=====光学異性体分離カラム===== | =====光学異性体分離カラム===== | ||
: 光学異性体分離カラムはアミノ酸のD体とL体や医薬品などの光学異性体化合物の分析・分取に用いられている。 | : 光学異性体分離カラムはアミノ酸のD体とL体や医薬品などの光学異性体化合物の分析・分取に用いられている。 | ||
====検出器==== | ====検出器==== | ||
様々な検出器が開発されており紫外可視吸光度（UV/Vis）検出器、[[蛍光]]検出器、電気化学検出器、[[質量分析計]]、蒸発光散乱検出器などが用いられている。HPLCにおいて、最も汎用的な検出器はUV/Vis 検出器であり、次いで蛍光検出器、電気化学検出器の順である。 | |||
==== データ処理ソフトウェア ==== | ==== データ処理ソフトウェア ==== | ||
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====アイソクラティック法とグラジエント法==== | ====アイソクラティック法とグラジエント法==== | ||
目的物質を移動相の溶媒の性質を変えて分離条件良く分析する方法には、アイソクラティック（Isocratic）法とグラジエント（Gradient）法がある。アイソクラティック法では単一な移動相を用いシンプルな装置で分析する(図1-A)。移動相の組成は複雑で、緩衝溶液のほかに有機溶媒やイオンペア試薬の添加をすることが多い。一方のグラジエント法は、2種類以上の移動相を用いるためHPLCシステムが少々複雑になる。一般的には移動相として水系の[[wikipedia:JA:緩衝溶液|緩衝溶液]]と[[wikipedia:JA:有機溶媒|有機溶媒]]の2つを用い、徐々に濃度勾配をつけて分離を行う。この方法で良い分離が得られない場合は、移動相の濃度をステップワイズに変えたり、これと直線的に変える方法を組み合わせるとよい。 | |||
====イオンペア試薬==== | ====イオンペア試薬==== | ||
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試料の前処理として、摘出した脳組織にすみやかに5〜10倍量の0.2 M[[wikipedia:JA:過塩素酸|過塩素酸]]（PCA）(100 μM [[wikipedia:JA:EDTA|EDTA]]･2Na含有)を加え、超音波で30秒間ホモジナイズした。次に、除タンパクを完全にするため氷中で30分間放置した後、4 ℃で10,000 rpm × 15分間遠心し、上清を採取した。上清は20倍に希釈し、15 μlを HPLCサンプルとした。サンプルは、オートサンプラー内にてOPA試薬と反応し、HPLCで分析した。すなわち蛍光誘導化のため反応型のオートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μl、サンプル15 μl、100 mM ホウ酸緩衝液（pH 10.0）20 μlを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル35 μlをHPLCにインジェクションした。<br > 分析例として、図2に0.5~20 pmol/μlのスタンダード(C)と脳組織をホモジネートしたサンプル(D)を分析したクロマトグラフを示した。定量限界は、0.5 pmol/μlであった。このクロマト条件においては、脳内のグルタミン酸とGABAの濃度は充分な測定感度範囲に入り、その他の生体アミノ酸（[[アスパラギン酸]]、[[wikipedia:JA:セリン|セリン]]、[[wikipedia:JA:アスパラギン|アスパラギン]]、[[wikipedia:JA:アルギニン|アルギニン]]、[[グリシン]]、[[wikipedia:JA:アラニン|アラニン]]、[[wikipedia:JA:タウリン|タウリン]]）も同時一斉分析を行うことが可能である。 | 試料の前処理として、摘出した脳組織にすみやかに5〜10倍量の0.2 M[[wikipedia:JA:過塩素酸|過塩素酸]]（PCA）(100 μM [[wikipedia:JA:EDTA|EDTA]]･2Na含有)を加え、超音波で30秒間ホモジナイズした。次に、除タンパクを完全にするため氷中で30分間放置した後、4 ℃で10,000 rpm × 15分間遠心し、上清を採取した。上清は20倍に希釈し、15 μlを HPLCサンプルとした。サンプルは、オートサンプラー内にてOPA試薬と反応し、HPLCで分析した。すなわち蛍光誘導化のため反応型のオートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μl、サンプル15 μl、100 mM ホウ酸緩衝液（pH 10.0）20 μlを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル35 μlをHPLCにインジェクションした。<br > 分析例として、図2に0.5~20 pmol/μlのスタンダード(C)と脳組織をホモジネートしたサンプル(D)を分析したクロマトグラフを示した。定量限界は、0.5 pmol/μlであった。このクロマト条件においては、脳内のグルタミン酸とGABAの濃度は充分な測定感度範囲に入り、その他の生体アミノ酸（[[アスパラギン酸]]、[[wikipedia:JA:セリン|セリン]]、[[wikipedia:JA:アスパラギン|アスパラギン]]、[[wikipedia:JA:アルギニン|アルギニン]]、[[グリシン]]、[[wikipedia:JA:アラニン|アラニン]]、[[wikipedia:JA:タウリン|タウリン]]）も同時一斉分析を行うことが可能である。 | ||
[[ファイル:HPLC 図3_横.jpg|thumb|600px|'''図 3. (A) HPLCのフローチャート. (B) 2 pmol/μlのスタンダード. (C) 脳組織ホモジネートのサンプル.'''<br />[分析条件] 装置：ポンプHITACHI L-2130，検出器：EICOM L7480とGL Sciences GL-7453A，カラムオーブン：EICOM CTC-100，デガッサー：EICOM DG-100，オートサンプラー：EICOM，ソフトウェア：PowerChrom EPC-500，トラップカラム：COSMOSIL Guard 5C18-MS-II(4.6ID×10 mm), 分離用カラム：COSMOSIL 5C18-MS-II(4.6ID×150 mm), 流速：1.1 ml/min, カラム温度：36 ℃, 励起波長：340 nm, 蛍光波長：440 nm．]] | |||
====測定例２（スイッチングバルブ法）==== | ====測定例２（スイッチングバルブ法）==== | ||
図3-Aに示したHPLCの構成で、アイソクラティック法を用いて脳組織のホモジネートを分析した。<br />移動相は2種類あり、移動相Aに[[wikipedia:JA:クエン酸|クエン酸]]−リン酸緩衝液 pH 5.8, 12%アセトニトリル、移動相Bにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 6.2, 25%アセトニトリルを用い15分間で1分析を行った。スイッチングバルブは、インジェクションから1分30秒で切り替わり、12分後に元の流路に戻るセッティングをした。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬5 mgをメタノール200 μlで溶解した後、2メルカプトエタノール5 μl、0.1 M Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>溶液800 μl加え、調製した。試料の前処理は、測定例（1）と同様に行い、上清を1200倍に希釈して15 μlをHPLCサンプルにした。蛍光誘導化のため、オートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μl、サンプル15 μlを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル10 | 図3-Aに示したHPLCの構成で、アイソクラティック法を用いて脳組織のホモジネートを分析した。<br />移動相は2種類あり、移動相Aに[[wikipedia:JA:クエン酸|クエン酸]]−リン酸緩衝液 pH 5.8, 12%アセトニトリル、移動相Bにクエン酸−リン酸緩衝液 pH 6.2, 25%アセトニトリルを用い15分間で1分析を行った。スイッチングバルブは、インジェクションから1分30秒で切り替わり、12分後に元の流路に戻るセッティングをした。蛍光誘導化試薬は、OPA試薬5 mgをメタノール200 μlで溶解した後、2メルカプトエタノール5 μl、0.1 M Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>溶液800 μl加え、調製した。試料の前処理は、測定例（1）と同様に行い、上清を1200倍に希釈して15 μlをHPLCサンプルにした。蛍光誘導化のため、オートサンプラーのサンプルラックを12 ℃に冷却、蛍光誘導化試薬15 μl、サンプル15 μlを加え30 ℃で2分間インキュベートし、誘導体化されたサンプル10 μlをインジェクションした。高感度でグルタミン酸とGABAを15分以内で分析できる。 | ||
===神経伝達物質の分析（電気化学検出法）=== | |||
====電気化学検出の原理==== | |||
[[ | : [[wikipedia:JA:酸化還元活性|酸化還元活性]]を有する物質を高感度に検出する方法である。一定の電位を印加した電極上で物質が[[wikipedia:JA:酸化|酸化]]又は[[wikipedia:JA:還元|還元]]された時に流れる電流を検出する。電流量は濃度に比例する為、定量分析が可能である。検出器には、電流測定検出器 (Amperometric detector) と電量検出器(Coulometric detector) の2種類があり、一般的にHPLCにおいては電流測定検出器を用いることが多い。これは、電量検出器に比べて電解効率が大幅に低いものの、良いシグナルノイズ比・感度が得られるためである。検出セルは作用電極、参照電極、対極電極からなり、作用電極は測定対象に応じて[[wikipedia:JA:グラッシーカーボン|グラッシーカーボン]]、[[wikipedia:JA:グラファイト|グラファイト]]、[[wikipedia:JA:白金|白金]]などを使用する。電気化学検出は1950年代にKemuraによって最初にクロマトグラフィーの検出法として用いられ、1960年代後半から1970年代前半にかけてAdamsらにより[[カテコールアミン]]および[[wikipedia:JA:アスコルビン酸|アスコルビン酸]]の分析に応用された。それからさらなる改良が重ねられ、現在神経伝達物質およびその代謝物の定量方法として、一般的な技術となっている。詳細な測定原理や方法については、Meffordによる総説<ref name=ref2><pubmed>6163932</pubmed></ref>やZapataらのプロトコル<ref name=ref3><pubmed>19575473</pubmed></ref>等が参考となる。 | ||
====アセチルコリンおよびコリン==== | |||
[[アセチルコリン]]のHPLC-ECDを用いた分析は、1983年にPotterらによって最初に報告された。アセチル[[コリン]]は電気化学的に不活性である為、分離用の本カラムの下流に[[アセチルコリンエステラーゼ]] (AChE)および [[コリンオキシダーゼ]] (ChO) を固定化した酵素カラムを配置し、オンラインで加水分解・酸化することで生成した[[wikipedia:JA:過酸化水素|過酸化水素]]を白金電極にて検出する (印加電圧 +450 mV vs Ag/AgCl) 。陽イオン交換カラムとともに、移動相にリン酸緩衝液を用いることで、アセチルコリンとコリンの分離、そして短時間分析の両立が可能である。 | |||
==== | ====モノアミンおよびその代謝物==== | ||
グラファイト電極に +700 mV 程度の電位を印加することでカテコールアミン（[[ドーパミン]]、[[ノルアドレナリン]]、[[アドレナリン]]等）や、インドールアミン（[[セロトニン]]等）、およびその代謝物の酸化反応をfmolオーダーで検出する(図4-A）。酸化還元電位は物質に固有であり、印加電位を変えることで選択的な検出が可能である。カテコールアミンは特に酸化を受けやすく、印加電位を +500 mV 程度まで下げることで選択的に検出することができる。 | |||
HPLCにおける各成分の分離はアイソクラティック法で行われ、移動相に用いる有機溶媒の種類および濃度、イオンペア試薬の濃度、 pH が大きな影響を及ぼす。有機溶媒には主にメタノールおよびアセトニトリルが用いられるが、濃度を上げることでアミンとその代謝物の溶出時間は早くなり、イオンペア試薬の濃度を上げることでアミンの溶出時間のみ遅くなる。またpH を上げると、[[ジヒドロキシフェニル酢酸]]（DOPAC）や[[ホモバニリン酸]]（HVA）など酸性の代謝物の溶出時間は早くなる。最適な印加電圧、移動相条件、カラムの種類を選択することで、脳組織中のモノアミンとその代謝物の一斉分析や、脳透析液中のドーパミンおよびセロトニンの短時間での高感度同時分析も可能である。 | |||
[[ファイル:HPLC 図4_横.jpg|thumb|600px|'''図 4. (A) ドーパミンの酸化反応. (B) 標準物質の分析; 10-100 pg の範囲で定量性がある. (C) マウス線条体抽出物の分析; ドーパミン作動性ニューロンが多いことが分かる. (D) マウス小脳抽出物の分析; 線条体と全く異なる溶出パターンをすることが分かる.'''<br />[分析条件] 装置:エイコム社製システム（デガッサー：DG-300, ポンプ：EP-300, カラムオーブン：ATC-300, 検出器：ECD-300, EICOM), カラム : EICOMPAK SC-50DS (3.0ID × 150 mm, EICOM), 移動相: 83% 0.1 M 酢酸-クエン酸緩衝液(pH 3.5)/17% メタノール(190 mg/l SOS, 5 mg/l EDTA•2Na を含む), 流速:0.5 ml/min, 作用電極: グラファイト電極(WE-3G, EICOM), 印加電圧:+750 mV vs. Ag/AgCl(RE-100, EICOM), 注入量:10 μl, 温度: 25℃,<br /> | |||
MHPG:3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol, NA:Noradrenaline, AD:Adrenaline, DOPAC:3,4-dihydroxy-phenylacetic acid, NM:Normethanephrine, DA:Dopamine, 5-HIAA:5-Hydroxyindoleacetic acid, ISO:Isoproterenol, HVA:Homovanillic acid, 3-MT:3-Methoxytyramine, [[5-HT]]:5-Hydroxytryptamine]] | |||
[測定例] マウス脳組織中のモノアミンとその代謝物の一斉分析（図4-B,C,D） | [測定例] マウス脳組織中のモノアミンとその代謝物の一斉分析（図4-B,C,D） | ||
[[マウス]][[線条体]]片側および[[小脳]]を各々摘出し、120 | [[マウス]][[線条体]]片側および[[小脳]]を各々摘出し、120 μl の0.2 M過塩素酸(100 μM EDTA・2Na含有)でホモジナイズ後、氷上で15分放置した。次に、遠心分離 (15,000 rpm, 20 分, 4 ℃) を行い、上清をpH3付近に調製後、0.45 μm フィルターでろ過したものを測定試料とした。分析条件はエイコム情報<ref name=ref4>エイコム情報 No.25 モノアミンおよびそれらの代謝物の分析2; EICOMPAK SC-5ODS(φ3 mm)カラムによる脳ホモジネートサンプルの分析<br />''エイコム株式会社'', 2001.4.</ref>に従い、アイソクラティック法で行った。その結果、ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニンとその代謝物の合計10成分の同時分析が30分で可能であった（ISO：[[イソプロテレノール]], 内部標準物質）。同条件にて、脳組織を用いたサンプルにおいても妨害ピークなく分析ができる。 | ||
==最近のHPLCの傾向== | ==最近のHPLCの傾向== | ||
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===LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)=== | ===LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)=== | ||
[[wikipedia:jp:%E3%82%B8%E3%83%A7%E3%83%B3%E3%83%BB%E3%83%95%E3%82%A7%E3%83%B3|Fenn]] | [[wikipedia:jp:%E3%82%B8%E3%83%A7%E3%83%B3%E3%83%BB%E3%83%95%E3%82%A7%E3%83%B3|Fenn]]らによって[[質量分析]]のイオン化法である[[wikipedia:JA:エレクトロスプレーイオン化|エレクトロスプレーイオン化]]（ESI）法が開発されてから、HPLCの検出器として質量分析計が多様の物質測定に利用できるようになった。このシステムでは、極微量の試料を高感度に検出することが可能であり、同時に多くの物質の分子量・構造情報を得ることができるため、特に[[wikipedia:JA:プロテオミクス|プロテオミクス]]の分野で急速に発展した。しかし、[[wikipedia:JA:質量分析計|質量分析計]]を用いた物質の検出は、測定対象がイオン化することが前提であり、試料の調製やHPLC移動相の選択などに制約がある。そこで、他のHPLC検出器で得られた分析条件を用いることが難しく、新たな基礎検討を必要とすることが多い。その中、近年では内径0.075~0.1 mm のカラムを用い、50～500 nl/min 程度の低流速で送液を行うナノフローHPLCを用いることで、ペプチドやタンパク質消化物においてはamol レベルの検出が可能となっている。脳科学の分野でも、このLC-MSを用いたプロテオーム解析が盛んに行われている。 | ||
本稿で紹介したHPLC検出はごく一部であるが、HPLC分析を行うにあたり、測定対象の物性を理解した上で、それに応じた分析条件、検出器を用いることが重要である。 | 本稿で紹介したHPLC検出はごく一部であるが、HPLC分析を行うにあたり、測定対象の物性を理解した上で、それに応じた分析条件、検出器を用いることが重要である。 | ||
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==参考文献== | ==参考文献== | ||
<references /> | <references /> | ||