「ROCK」の版間の差分

　ROCK/Rhoキナーゼは活性型の低分子量GTP結合タンパク質Rhoにより活性化される分子量約160 kDaのserine/threonine kinaseであり、哺乳類にはROCK-IとROCK-IIの2つのアイソフォームが存在する。ROCKはミオシン軽鎖とミオシン軽鎖脱リン酸化酵素のリン酸化を介してミオシン軽鎖を活性化する。さらに、LIM-kinaseのリン酸化を介してアクチン脱重合因子であるcofilinを不活化し、アクチン脱重合を抑制する。これらの作用が協調して、Rho依存的なアクトミオシン束の形成を促す。その他にもROCKは数多くの基質をリン酸化して、細胞運動、細胞極性、細胞接着、細胞分裂、アポトーシス、転写制御など多様な生命機能に関わる<ref name=ref1><pubmed></pubmed></ref> <ref name=ref2><pubmed></pubmed></ref>。神経系においても、発生・発達期における神経管形成、神経突起伸展制御、シナプス形成に加え、成体でのシナプス可塑性に至るまで幅広い役割を担う。

　1985年に[[RhoA]]が新規の[[低分子量GTP結合タンパク質]]として同定されて以来、[[Rho]]を選択的に不活化する[[ボツリヌス菌]]由来の菌体外酵素C3や、Rhoの活性化変異体や不活性化変異体を用いた解析により、アクチン細胞骨格の再編成におけるRhoの重要性が示された<ref name=ref3><pubmed></pubmed></ref>。しかし当時はRhoの標的タンパク質は同定されておらず、Rhoの下流の細胞内情報伝達系は不明であった。GTP結合型（活性型）RhoAとの選択的結合を指標としたyeast two hybrid法、affinity chromatography、リガンドオーバーレイ法などにより、Rho標的タンパク質が次々に同定された<ref name=ref4><pubmed></pubmed></ref> <ref name=ref5><pubmed></pubmed></ref>。Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase（ROCK, Rho-kinase, ROK）は活性型Rhoにより活性化されるserine/threonine kinaseである<ref name=ref6><pubmed></pubmed></ref> <ref name=ref7><pubmed></pubmed></ref> <ref name=ref8><pubmed></pubmed></ref>。ROCKはミオシン軽鎖脱リン酸化酵素（myosin light chain phosphatase; MLCP）をリン酸化してその酵素活性を抑制し、ミオシン軽鎖（myosin light chain; MLC）のリン酸化と活性化を促す。またROCKはミオシン軽鎖を直接リン酸化し活性化することも知られる<ref name=ref9><pubmed></pubmed></ref> <ref name=ref10><pubmed></pubmed></ref>。さらにROCKはリン酸化によりLIM kinaseを活性化し、LIM kinaseはアクチン脱重合因子cofilinのリン酸化を促す<ref name=ref11><pubmed></pubmed></ref>。このリン酸化によりcofilinは不活化されアクチン脱重合が阻害される。これらの作用が協調することで、ROCKはRho依存的なアクトミオシン束の形成に寄与し、細胞に収縮力を与える。その他、Adducin、ERM（ezrin, radixin, moesin）タンパク質、I型Na+-H+交換体、中間径フィラメント（vimentin, glial fibrillary acidic protein, neurofilament）、微小管結合タンパク質（MAP2, Tau）、collapsin response mediator protein 2（CRMP2）、Par3などがROCKの基質の候補分子として同定されている<ref name=ref1 /> <ref name=ref2 /> <ref name=ref12><pubmed></pubmed></ref>。特にROCKによる[[CRMP2]]リン酸化が[[微小管]]制御を介しEphrinA5による神経突起退縮を促すこと<ref name=ref13><pubmed></pubmed></ref>、ROCKによるPar3リン酸化が遊走細胞の前後軸形成を促すこと<ref name=ref14><pubmed></pubmed></ref>などが示されている。

　[[マウス]]には1354アミノ酸のROCK-I（ROKβ, p160ROCK）と1388アミノ酸のROCK-II（ROKα, Rho-kinase）の2つのアイソフォームが存在する。どちらのアイソフォームもN末端側からキナーゼ領域、coiled-coil領域、Rho結合領域、PH（pleckstrin-homology）領域を有する。ROCK-IとROCK-IIはアミノ酸配列全体で65%の相同性を有しており、キナーゼ領域では約92%の相同性を示す<ref name=ref15><pubmed></pubmed></ref>。ROCKのC末端領域にはROCKのキナーゼ活性を抑制するauto-inhibitory領域が存在し、活性型RhoがROCKのRho結合領域に結合することでこの抑制が解除され、ROCKのキナーゼ活性が亢進する<ref name=ref16><pubmed></pubmed></ref>。ROCKはN末端領域同士で二量体を形成し、この二量体形成はROCKのキナーゼ活性に必須であると考えられている<ref name=ref17><pubmed></pubmed></ref> <ref name=ref18><pubmed></pubmed></ref>。ESTデータベースを用いた解析から、数多くの臓器ではROCK-IとROCK-IIの両方が発現している。しかし、ROCK-Iは[[脾臓]]、胸腺、[[精巣]]、血液などに発現が高く、ROCK-IIは脳、大腸、[[心臓]]などに高発現していることが報告されている<ref name=ref19><pubmed></pubmed></ref>。平滑筋細胞において、ROCK-Iは細胞膜や細胞膜近傍の小胞に、ROCK-IIは中心体に局在することが報告されており、同一細胞内においてもアイソフォーム間での細胞内局在の違いが示唆されている20。脳内では、ROCK-Iは主にグリア細胞や血管に発現し、ROCK-IIは主に神経細胞に発現している。ROCK-IIについては、神経細胞の成長円錐、軸索、シナプス前終末、スパインでの局在が免疫電子顕微鏡法により確認されている<ref name=ref20><pubmed></pubmed></ref>。

　[[神経管]]は外胚葉に由来する[[神経板]]が背側方向に閉鎖することで形成されるが、この過程には神経板を構成する神経上皮細胞の頂端側での[[アクトミオシン]]収縮力が必要である。神経上皮細胞の頂端側で見られるミオシン軽鎖のリン酸化がROCK-IとROCK-IIの阻害薬であるY27632（Ref. 10）により消失すること21、さらにY-27632やMyosin IIの特異的阻害薬であるBlebbistatinがトリやマウスの胚の神経管閉鎖を阻害することが示された<ref name=ref21><pubmed></pubmed></ref> <ref name=ref22><pubmed></pubmed></ref>。以上の結果は、ROCKによるアクトミオシン収縮が神経管閉鎖に重要であることを示唆している。さらなる研究により、アダプタータンパク質Shroom3により神経管内腔側（神経上皮細胞の頂端側に相当する）にROCKが局在化し、さらに[[PDZ]]-RhoGEFにより活性化されたRhoがROCKを活性化することが示されている<ref name=ref23><pubmed></pubmed></ref> <ref name=ref24><pubmed></pubmed></ref>。

　神経突起の形成と伸展は、突起先端の[[成長円錐]]でのアクチン細胞骨格の再編成と、それに引き続く微小管の配向、安定化から成る。成長円錐は高い運動性を持った扇形の構造であり、[[軸索]]ガイダンス因子による軸索の伸長や退縮、さらに軸索伸長の方向の制御に深く関わる（参照：脳科学辞典「成長円錐」）。

　ROCK阻害薬Y-27632やミオシン阻害薬Blebbistatinを用いた実験から、アメフラシの成長円錐でのアクチン動態やアクトミオシン束の形成にROCKによるミオシン活性化が重要であることが示されている<ref name=ref25><pubmed></pubmed></ref> <ref name=ref26><pubmed></pubmed></ref>。さらに、[[げっ歯類]]の[[初代培養神経]]細胞では、神経突起の伸展がROCK阻害薬Y-27632により促進し、ROCKの活性化変異体により抑制されることから、ROCKの活性化が神経突起の伸展を抑制することが明らかとなった<ref name=ref27><pubmed></pubmed></ref>。小脳顆粒細胞ではROCKが神経突起の伸展の開始を抑制し神経突起の数を決定すること、その過程にRho-ROCK-LIM kinase経路によるアクチン脱重合抑制が重要であることが示された<ref name=ref28><pubmed></pubmed></ref>。さらにROCKは軸索ガイダンス因子であるEphrinA5による軸索退縮に重要である。EphrinA5はEphAに結合し、Rho GEFであるEphexinを介してRhoを活性化する<ref name=ref29><pubmed></pubmed></ref>。Rhoにより活性化されたROCKは、アクトミオシン束を形成するとともに、CRMP-2による微小管重合を抑制する<ref name=ref13 />。[[CRMP-2]]は[[チュブリン]]二量体に結合して微小管形成を促進するタンパク質であり、ROCKによるリン酸化はその機能を抑制する。また、RhoAの活性化変異体やリゾホスファチジン酸（LPA）によるRhoの活性化は、樹状突起の複雑さを減少させる<ref name=ref30><pubmed></pubmed></ref>。この樹状突起の単純化は、ROCK阻害薬Y-27632で抑制され、ROCKの活性化変異体により[[模倣]]されることから、Rho-ROCK経路は樹状突起の枝分かれを抑制すると考えられている。

　[[軸索再生]]においてもROCKは抑制的に働く。[[脊髄損傷]]後の軸索再生は、[[myelin-associated glycoprotein]]（[[MAG]]）、[[Nogo]]-A、chondroitin sulfate proteoglycans （CSPGs）、oligodendrocyte myelin glycoprotein（OMgp）などの[[ミエリン]]および[[オリゴデンドロサイト]]由来の軸索伸展抑制因子により阻害される。これらの抑制因子の作用はROCK阻害薬Y-27632により抑制される<ref name=ref31><pubmed></pubmed></ref>。さらにROCK-II欠損マウス由来の後根神経節細胞では、Nogo-22やCSPGsによる軸索伸展抑制作用が減弱することから<ref name=ref32><pubmed></pubmed></ref>、これらの軸索伸展抑制因子の作用にはROCK-IIが必須である。興味深いことに、ROCKII欠損マウスでは、脊髄損傷後の軸索再生が促進されることも報告されており<ref name=ref32 />、脊髄損傷の治療薬としてのROCK阻害薬の可能性が検討されている<ref name=ref33><pubmed></pubmed></ref>。

　樹状突起スパインは、神経細胞の樹状突起から突き出たアクチン細胞骨格に富む小さな突起であり、中枢神経系の主な[[興奮性シナプス]]入力部位である。スパインの形態変化はアクチン再構築に依存することから、ROCKの関与について興味が持たれてきた。[[スライス培養]]した[[海馬]][[CA1]]の錐体神経細胞では、ROCK阻害薬Y-27632によりスパインの長さが増大し、スパインの運動性が亢進する<ref name=ref34><pubmed></pubmed></ref>。海馬初代培養神経細胞では、Myosin IIB阻害薬Blebbistatinの処理やRNA干渉法によるMyosin IIbの発現抑制もスパインの長さの増大とスパインの運動性の亢進を引き起こす<ref name=ref35><pubmed></pubmed></ref>。これらの結果から、ROCKはMyosin IIbを活性化してスパインの安定化を促すと考えられている。

　海馬スライスのCA1錐体神経細胞での実験では、スパインの大きさとAMPA型[[グルタミン酸受容体]]を介した[[シナプス]]後電流が相関する<ref name=ref36><pubmed></pubmed></ref>。さらにスパインは長期増強（long-term potentiation）に伴い増大し、長期抑圧（long-term depression）に伴い縮小することから、シナプス可塑性におけるスパインの形態変化の意義が示唆されてきた<ref name=ref37><pubmed></pubmed></ref> <ref name=ref38><pubmed></pubmed></ref>。グルタミン酸受容体の局所的な活性化によりスパインの増大が誘導されるが、このスパイン増大の初期相がRhoの活性阻害や発現抑制、ROCK阻害薬Glycyl-H-1152により抑制されることが示された。さらに、グルタミン酸受容体活性化によるスパインでのRhoAの活性化はCaMKII阻害薬で減弱した。これらの結果から、グルタミン酸受容体はCaMKIIを介してRho-ROCK経路を活性化しスパイン増大を誘導すると考えられている<ref name=ref39><pubmed></pubmed></ref>。

　このRho-ROCK経路の役割に合致し、ROCK-II欠損マウスでは海馬の[[シャッファー側枝]]とCA1[[錐体細胞]]の間の[[グルタミン酸]]作動性シナプス伝達の長期増強が減弱している<ref name=ref40><pubmed></pubmed></ref>。海馬スライス培養では、シナプス活動やNMDA受容体刺激はROCK依存的にスパインにおけるミオシン軽鎖リン酸化を誘導する。さらにシャッファー側枝－CA1シナプスでのシナプス伝達の長期増強がMyosin IIbの発現抑制やMyosinII阻害薬Blebbistatinの処理により減弱する<ref name=ref41><pubmed></pubmed></ref>。これらの結果は、グルタミン酸受容体による長期増強にRho-ROCK経路を介したアクトミオシン束形成が重要であることを示唆している。

　神経活動に影響を与えるその他のROCKの働きも示唆されているが、その詳細については不明な点が多い。例えば、脳幹スライス培養を用いた実験では、ROCK阻害薬H1152により[[シナプス前終末]]のアクティブゾーンへの[[シナプス小胞]]のドッキングが抑制される<ref name=ref42><pubmed></pubmed></ref>。LPAにより活性化したROCKがT型カルシウムチャネルをリン酸化し、Cav3.1を抑制し、Cav3.2を促進することも報告されている<ref name=ref43><pubmed></pubmed></ref>。

　記憶・学習におけるROCKの役割についても報告されている。[[恐怖条件付け]]直前の外側[[扁桃体]]へのROCK阻害薬Y-27632の局所注入では、[[短期記憶]]は保持されるものの[[長期記憶]]の形成が阻害される<ref name=ref44><pubmed></pubmed></ref>。モリス水迷路試験を用いた研究では、学習後の海馬へのROCK阻害薬Y-27632の局所注入が空間記憶の保持を低下させることが報告されている<ref name=ref45><pubmed></pubmed></ref>。しかし、記憶・学習を担うシナプス可塑性やそれに伴うスパインの形態変化にROCKが関与するかについては今後の課題である。