「シナプス小胞」の版間の差分

{{box|text=　シナプス顆粒は、[[神経細胞]]の[[軸索]]終末である[[シナプス前終末]]に蓄積している分泌小胞の総称である。シナプス顆粒は、神経細胞の興奮に応じて[[シナプス前膜]]と[[膜融合]]を起こし、内容物（[[神経伝達物質]]）を[[シナプス間隙]]に放出（[[エキソサイトーシス]]）することによって、[[シナプス伝達]]を行う。シナプス前終末にはこれらの[[分泌小胞]]が多数密集して存在しており、[[wikipedia:ja:電子顕微鏡|電子顕微鏡]]像では顆粒状に観察される。[[海馬]]や[[大脳皮質]]に存在する1 μm程度のシナプス前終末では〜200個のシナプス顆粒が含まれている。 神経伝達物質は、特異的な[[小胞トランスポーター]]タンパク質によってシナプス小胞内に濃縮される。シナプス小胞は、[[アクティブゾーン]]にドックしており、Ca²⁺の流入とともに膜融合を引き起こし、神経伝達物質を放出する。その過程においては、Ca²⁺を感知する[[シナプトタグミン]]、[[SNAREタンパク質]]である[[シナプトブレビン]]と[[シンタキシン]]、[[SNAP-25]]が重要な役割を果たしている。膜融合後は、[[クラスリン]]被覆に依存したエンドサイトーシスにより小胞膜画分が回収され、再利用される。}}

[[image:シナプス小胞1.jpg|thumb|350px|'''図1．シナプス小胞のリサイクリング''']]

　ちょうど同時期にPaladeらは[[電子顕微鏡]]で脳組織を観察し、シナプス前部と思われる構造体に数百もの小さな袋状の膜構造物を観察し、この小胞がquantaの正体であることを提唱した。「シナプス小胞」の発見である<ref name=ref2>'''Palade, G.E., Palay, S.L.,'''<br>Electron microscope observations of interneuronal and neuromuscular synapses. <br>''Anat. Rec.'', 1954. 118: p. 335-336.</ref>。

　1980年代になり、[[w:John_Heuser|Heuser]]と[[w:thomas_reese|Reese]]らは電気刺激直後（5ミリ秒）に固定した[[神経筋接合部]]を電子顕微鏡下で観察し、シナプス小胞と[[形質膜]]が融合している像を見いだし、神経伝達物質の放出は伝達物質を貯蔵したシナプス小胞の膜と形質膜の[[膜融合]]によって起こることを提唱した<ref name=ref3><pubmed>4348786</pubmed></ref>。また、痙攣を引き起こす[[ショウジョウバエ]]の[[温度感受性変異体]]である[[shibire]]ミュータントでは、シナプス前部からシナプス小胞が枯渇し、形質膜上にはオメガ（Ω）様の膜陥入像が見られた<ref name=ref4><pubmed>2573698</pubmed></ref>。温度を下げるとシナプス前部にシナプス小胞が再び現れることから、形質膜に融合したシナプス小胞はシナプス前部において再合成されることが示唆された。これらの歴史的な知見により、神経伝達物質の充填→[[エキソサイトーシス]]による膜融合→[[エンドサイトーシス]]による再形成形成というシナプス小胞の一連のサイクルが明らかになった（図1）。

[[image:シナプス小胞2.jpg|thumb|350px|'''図2．神経伝達物質の再充填'''<br>神経伝達物質のシナプス小胞への再充填はプロトンポンプが形成するプロトン電気化学勾配に依存している。グルタミン酸は膜電位勾配 (DY)を、アセチルコリン・モノアミン類は化学勾配(DpH)を主に駆動力として用いる。GABAやグリシンは、その中間に位置する。]]

　膜電位とpH勾配の割合は小胞膜に存在する[[塩化物イオンチャネル]]の活性によって制御されていると考えられている<ref name=ref10><pubmed>17880890</pubmed></ref>。[[哺乳類]]脳内に存在する神経伝達物質の内、正の電荷をもつ[[アセチルコリン]]や[[モノアミン]]類はpH勾配によって輸送されるが、負の電荷をもつ[[グルタミン酸]]は主に膜電位によって輸送される（図2）。[[GABA]]や[[グリシン]]はそれらの中間に位置する。すでに[[VAChT]]（アセチルコリン）、[[VMAT1]]/[[VMAT2|2]]（モノアミン）、[[VGLUT1]]/[[VGLUT2|2]]/[[VGLUT3|3]]（グルタミン酸）、VGAT（GABAとグリシン）がクローニングされているが、それぞれのトランスポーターの輸送メカニズムは不明である。最近、VGLUTの相同遺伝子として小胞への[[ATP]]輸送を司る[[VNUT]]が同定された<ref name=ref11><pubmed>18375752</pubmed></ref> <ref name=ref12><pubmed>23886392</pubmed></ref>。

[[image:シナプス小胞3.jpg|thumb|350px|'''図3．エキソサイトーシスの分子機構'''<br>A. アクティブゾーン(active zone)には、Munc13, Rim, CASTなどの巨大タンパク質が存在し、Munc18やSyntaxinと複合体を形成している。<br>B. SNARE複合体を形成するとコンプレキシンが結合し、融合を阻害している。C→D. 細胞質にカルシウムが流入すると、Munc18やコンプレキシンが解離し、SynaptotagminがCa²⁺センサーとして働く。E. 小胞膜と形質膜が融合した後のSNARE複合体はNSFとaSNAPの働きで解離する。]]

　シナプス前部におけるエキソサイトーシスは、時空間的に厳密な制御を受けている。活動電位がシナプス前部に到達すると[[電位依存性Ca2+チャネル|電位依存性Ca²⁺チャネル]]を通じて細胞外から[[CA2|Ca2]]+が流入し、100ミリ秒以内にエキソサイトーシスが起こる。従って、Ca²⁺依存的なシナプス小胞と形質膜の膜融合過程には、複雑な酵素反応が入る余地がない。すなわち、瞬時に放出可能な一部のシナプス小胞は形質膜に結合（ドッキング）した状態で、Ca²⁺濃度の上昇によるエキソサイトーシスの惹起に備えていると考えられている。現在では、シナプス小胞のエキソサイトーシスは、以下に詳述する（1）[[ドッキング]]、（2）[[プライミング]]、（3）[[膜融合]]、の3つの過程が異なる分子で制御されていると考えられている（図3）。

[[image:シナプス小胞4.jpg|thumb|350px|'''図4．エンドサイトーシスの分子メカニズム'''<ref name=ref35><pubmed>22763746</pubmed></ref>より（改変）]]

　エンドサイトーシスには、刺激頻度に応じて要する時間が異なる幾つかの仕組みが存在すると考えられている。比較的弱い刺激でエキソサイトーシスを起こした場合、クラスリン被覆に依存したエンドサイトーシスが1分以内で完了する（時定数15−20秒程度）。それに対して、1秒以内に完了する高速のエンドサイトーシスも観察されており、[[Kiss-and-Run]]と呼ばれている。また、強い連続刺激を与えた時には、エンドサイトーシスを支える分子機構が飽和するため、遅いエンドサイトーシスが起こる。この時、エキソサイトーシスで形質膜に挿入したシナプス小胞膜成分を回収するために、大きな膜構造の陥入像が見られるため、[[バルクエンドサイトーシス]]と名付けられている。[[クラスリン]]被覆依存的エンドサイトーシスの分子機構については、多くの研究により詳細が明らかになっているので、以下の（1）〜（6）に概説する<ref name=ref35><pubmed>22763746</pubmed></ref>（図4）。

'''（2）アダプタータンパク質群の集積'''：脂質膜とクラスリン被覆の結合を媒介するのが、[[AP-2]]や[[AP180]]などの[[アダプタータンパク質]]である。[[Stonin 2]]、[[epsin]]などの関与も示唆されている。

'''（4）膜の分断'''：クラスリン被覆小胞が最終的に形質膜から分断される過程を司るのはダイナミンというタンパク質である。ダイナミンは[[GTP]]分解酵素活性をもち、GTPを加水分解する時のエネルギーを使って、立体構造を変化させることで膜の分断を行なうと考えられている。古くは[[ショウジョウバエ]]の温度感受性変異体であるshibireの変異遺伝子としてエンドサイトーシス過程における膜の最終的な分断に関わることが提唱されていた<ref name=ref4 />（上述）。一方、ダイナミン1ノックアウトマウスの研究から、ダイナミン1がなくてもエンドサイトーシスが完全に損なわれるわけではないことが示された<ref name=ref36><pubmed>17463283</pubmed></ref>。電子顕微鏡像の三次元再構築を行なうと、ダイナミン1ノックアウトマウスのシナプス前部には、出来かけのクラスリン被覆小胞が形質膜から伸びた管状の膜構造に房状に付着していると思われる様子が観察された。

'''（6）多様なエンドサイトーシス関連タンパク質群'''：上記以外にもエンドサイトーシスに関わるとされるタンパク質が多く見つかっているが、その詳細な機能は未解明である。エンドフィリンやアンフィフィシンなどはBAR部位という特徴的な部位を持ち、膜に結合することで膜の歪曲を決定すると考えられている。例えばエンドフィリンは発見当初、クラスリン被覆小胞の形成が完了する際に、形質膜と小胞のつなぎ目のネック部分に集積して、ネックの直径を決めると考えられていた<ref name=ref37><pubmed>20059951</pubmed></ref>。また、エンドフィリンのC末端側がダイナミンと直接結合することでダイナミンをネック部分に集積させる役割が提唱されていた。しかしながら、エンドフィリン1~3トリプルノックアウトマウスでは、予想されたクラスリン被覆小胞の形質膜での集積ではなく、シナプス前部細胞質におけるクラスリン被覆小胞の割合の増加が観察された<ref name=ref38><pubmed>22099461</pubmed></ref>。このことからエンドフィリンはクラスリン被覆小胞の形質膜からの分断以降のクラスリン被覆の脱落過程において重要な役割を果たしていることが明らかになった。その他にも[[脂質脱リン酸化酵素]]である[[Synaptojanin]]を含め多くのタンパク質がエンドサイトーシスを制御していると考えられている。

　シナプス小胞は直径40ナノメートルと小さいため、通常の光学顕微鏡で動態を観察するのは困難である。そのため従来のシナプス前部研究はシナプス後部において測定するシナプス応答から類推したり、[[脳幹]]に存在する巨大シナプスである[[ヘルドのカリックスシナプス]]を標本とした実験に頼っていた。近年、[[蛍光指示薬]]や[[蛍光タンパク質]]を利用したイメージング技術が開発され、分子操作が容易な神経培養細胞を用いたシナプス前部研究が可能になった。以下に、シナプス小胞リサイクリングを研究するための代表的な研究手法を紹介する。

　胎児期あるいは生誕直後の海馬や[[大脳皮質]]から神経細胞の分散培養を作成し、電気生理学的手法により後シナプス電流を検出することにより、シナプス前部での現象を類推することができる。胎生致死の遺伝子欠損マウスの場合でも、神経[[初代培養]]は作成できる場合が多いのが利点である。初期のシナプス小胞タンパク質の機能解析は、特に海馬由来の[[オータプス培養]]（1つの神経細胞が自分自身にシナプスを作る）が積極的に用いられた。神経培養細胞に遺伝子導入する方法も改良が重ねられ、遺伝子欠損の影響のみならず、レスキュー実験やタンパク質の構造−機能連関研究などに威力を発揮できる実験系である<ref name=ref27 /> <ref name=ref28 /> <ref name=ref39><pubmed>16682332</pubmed></ref>。

　哺乳類の脳幹部位に存在する[[聴覚]]系の中継シナプスである。その類い稀な大きさ故、脳幹[[スライス]]標本においてシナプス前部とシナプス後部から同時に[[パッチクランプ記録]]が可能である。また、シナプス前部側の[[ガラス電極]]にシグナル分子を修飾する薬物や内在性タンパク質相互作用を修飾する[[wj:抗体|抗体]]や[[wj:ペプチド|ペプチド]]を導入し、そのシナプス伝達に対する効果をシナプス後部側の応答で検証できる。更に、[[膜容量]]測定法を適用することで、エキソサイトーシスやエンドサイトーシスに伴う膜容量の変化を測定することも可能であり、シナプス前部の分子メカニズムを調べるための中枢神経系のモデル標本として用いられている<ref name=ref40><pubmed>16896951</pubmed></ref>。

　1990年代に[[wikipedia:Willam Betz|Willam Betz]]らは[[スチリル色素]]([[FM色素]])を開発し、生きた細胞の[[細胞膜]]を蛍光標識することに成功した<ref name=ref42><pubmed>1553547</pubmed></ref> <ref name=ref43><pubmed>22194270</pubmed></ref>。FM色素は両親媒性の蛍光色素で、疎水性の部分が膜に侵入するが、親水性の部分があるために脂質二重膜の片側に留まる性質を持つ。また、膜に結合することで蛍光が数十倍〜100倍に上昇すること、膜への結合は可逆的であることも特徴である。

　[[緑色蛍光蛋白質]]([[GFP]])の蛍光強度は溶液のpHにより変化する。GFPの遺伝子に変異を加え蛍光強度のpH依存的変化を増幅させた変異体が[[pHluorin]]である<ref name=ref44><pubmed>9671304</pubmed></ref>。pHluorinは7.1程度のpKa値を示し、中性域では強い[[wj:蛍光|蛍光]]を発するが、弱酸性域では蛍光が減弱する。この蛍光変化は可逆的である。シナプス小胞内腔はV-ATPaseの働きにより弱酸性に保たれているため、pHluorinをシナプス小胞タンパク質の内腔側に融合させて遺伝子導入させると、小胞内腔に存在する時は蛍光を発せず、エキソサイトーシスに伴って細胞外の中性溶液に暴露された時に強い蛍光を発する。その後形質膜に移行したpHluorinを持つシナプス小胞タンパク質がエンドサイトーシスによって新たな小胞に回収されると、小胞内腔が酸性化され、再び蛍光が消失する。最初に用いられたSynaptobrevinに融合させたSynaptopHluorinは細胞表面への局在が多くシグナル−ノイズ比が低いことが問題となっていたが、その後SynaptophysinやVGLUT1の内腔側に融合させた改良版が作られ<ref name=ref45><pubmed>16982422</pubmed></ref> <ref name=ref46><pubmed>16815333</pubmed></ref>、1小胞イメージングなども可能となり、エンドサイトーシスや小胞酸性化の動態や速度論的解析が現在活発に進められている<ref name=ref47><pubmed>18077369</pubmed></ref>。ただし、厳密に言えばpHluorinを融合させたタンパク質の動態を観察しているのであり、小胞「膜」のエンドサイトーシスを直接観察している訳ではないことに留意する必要がある。

[[image:シナプス小胞5.jpg|thumb|350px|'''図5．海馬シナプス電子顕微鏡像'''<br>透明な顆粒がシナプス小胞、黒い顆粒が有芯小胞（矢頭）。<br>文献<ref name=ref50><pubmed>22398727</pubmed></ref>より許可を得て転載 (Elsevier License ; 2903510133723)。]]

　中枢神経系シナプスの一部にはシナプス小胞よりも大きく(直径100~300ナノメートル)、電子顕微鏡で内腔が黒く見える[[大型有芯顆粒]]（Large Dense Core Vesicle: LDCV）が含まれるものがある（図5）。

　シナプス小胞はシナプス前部の形質膜形質膜近傍からクラスター状に多数存在するのに対して、LDCVはシナプス部位から離れた部位に散在している。シナプス小胞には速い神経伝達を担うグルタミン酸、GABA、[[グリシン]]、アセチル[[コリン]]が含まれているのに対して、LDCVには[[ドーパミン]]などの[[モノアミン]]類や[[神経ペプチド]]、多種多様な[[神経栄養因子]]を神経伝達物質として含まれている。また、[[交感神経]]のシナプスにおいては、[[ノルエピネフリン]]や[[セロトニン]]を含む60〜80 nmの[[有芯小胞]]が見られ、これをLDCVと区別して[[small dense core vesicle]]（SDCV）と呼ぶ場合もある。シナプス小胞とLDCVは中に含まれる神経伝達物質の違いに加え、様々な性質が異なる。シナプス小胞から放出される神経伝達物質神経伝達物質は、主にシナプス後部側の[[イオンチャネル]]型受容体に作用するため、シナプス後部側に電気的なシナプス応答を引き起こす。一方、LDCVに含まれる伝達物質はシナプス後部側の[[Gタンパク共役型受容体]]や[[神経栄養因子受容体]]に作用し、[[セカンドメッセンジャー]]を介したシナプス伝達の修飾を行う。

 

　中枢神経系でのLDCVからの伝達物質放出機構は明らかではないが、クロム親和性細胞を用いた研究から、シナプス小胞同様、SNARE複合体による膜融合で伝達物質放出を行っていると考えられている。しかし、シナプス小胞とLDCVでは[[カルシウム]]に対する応答性に違いがあることが知られている。伝達物質放出のためにシナプス小胞がシナプス前部局所での高濃度のCa²⁺濃度上昇を必要とするのに対し、LDCVは持続的な低濃度のCa²⁺濃度上昇を必要とする<ref name=ref48><pubmed>15572159</pubmed></ref>。SNARE複合体に含まれるSynaptobrevinやCa²⁺センサーであるSynaptotagminなどにはアイソフォームがあり、シナプス小胞とLDCVに存在するこれらのアイソフォームが異なる可能性が示唆されている<ref name=ref49><pubmed>21551071</pubmed></ref> <ref name=ref50 />。

　このようなシナプス活性帯からの距離的な差異や、活性化させる受容体の違い、また[[シナプス前膜]]と膜融合を起こすのに必要なカルシウムの応答性の相違などによって、LDCV内の伝達物質はシナプス小胞内の神経伝達物質よりも遅い速度でシナプス後部側に作用する。更に、シナプス小胞は伝達物質の放出後、エンドサイトーシスによって再合成され、シナプス前部局所で伝達物質の再充填が行われるのに対し、LDCVは一度きりの放出で、新たなLDCVは[[トランスゴルジネットワーク]]から生成される、というように生成過程においても違いがある。シナプス前部にシナプス小胞とLDCVの両方が存在するシナプスが脳の各部位で見つかっている。そのようなシナプスではひとつの[[シナプス前終末]]に神経伝達物質を2種類以上有することになるが、この伝達物質の組み合わせは脳の部位によって異なり、 これがそれぞれのシナプスにおけるシナプス伝達の多様性に寄与していると考えられる<ref name=ref51><pubmed>    16847638</pubmed></ref>。