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「シングルセルRNAシーケンシング」の版間の差分
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→組織からの細胞、細胞核の分離
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単離した細胞は、そのまま10x Genomicsのシングルセル遺伝子発現解析のプラットフォームに導入することができるが、細胞表面分子マーカーに対する[[抗体]]や[[蛍光タンパク質]]レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS([[磁気ビーズカラム]])などによって、細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記の「統合解析」でも述べる。 | 単離した細胞は、そのまま10x Genomicsのシングルセル遺伝子発現解析のプラットフォームに導入することができるが、細胞表面分子マーカーに対する[[抗体]]や[[蛍光タンパク質]]レポーターなどを用いたFACS、[[パニング]]、MACS([[磁気ビーズカラム]])などによって、細胞の選択的濃縮や除去を行う場合もある。更に、抗体に抗体表示バーコードDNAをカップリングさせるCITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) については、下記の「統合解析」でも述べる。 | ||
なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNA-seqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNA-seq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNA-seqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多い。また、細胞質を持つ生細胞を利用したscRNA-seqとは違って、スプライシングの途上にある未成熟な核内転写産物を検出すること、更に検出できる遺伝子数も少なく、同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref name=Mereu2020><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始することが可能であるので、上述したscRNA-seqの問題である細胞解離酵素による処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、特に神経細胞で顕著である細胞の形状の多様性に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell | なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNA-seqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNA-seq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、snRNA-seqでは、FACSなどによる特定細胞集団の分離が困難であることが多い。また、細胞質を持つ生細胞を利用したscRNA-seqとは違って、スプライシングの途上にある未成熟な核内転写産物を検出すること、更に検出できる遺伝子数も少なく、同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref> <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref name=Habib2017><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref><ref><pubmed>32341560</pubmed></ref> <ref name=Mereu2020><pubmed>32518403</pubmed></ref>。一方で、snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始することが可能であるので、上述したscRNA-seqの問題である細胞解離酵素による処理などを避けることができる。更に、核を用いることで、大きな細胞体はマイクロ流体力学の流路で詰まりやすいなど、特に神経細胞で顕著である細胞の形状の多様性に伴うバイアスを減らすことができるといったメリットもある。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasの[https://www.protocols.io/groups/hca グループ]で公開されている。 | ||
通常のscRNA-seqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）、RamDA-seqなどを用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref> <ref><pubmed>29434199 </pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.02.131060]。 | 通常のscRNA-seqは、ポリアデニル化されたmRNAを検出しているが、MATQ-seq（multiple annealing and dC-tailing-based quantitative single-cell RNA-seq）、RamDA-seqなどを用いると、ポリアデニル化されていないRNAの検出も可能である<ref><pubmed> 28092691</pubmed></ref> <ref><pubmed>29434199 </pubmed></ref>[https://doi.org/10.1101/2020.06.02.131060]。 | ||
更に、RNAを分析するscRNA-seqではないが、遺伝子発現状態との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref> | 更に、RNAを分析するscRNA-seqではないが、遺伝子発現状態との関係が想定される[[オープンクロマチン]]領域を[[トランスポゾン]]を用いることで個々の細胞レベルで選択的に検出するsingle cell ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) <ref><pubmed>26083756</pubmed></ref><ref><pubmed>29434377</pubmed></ref><ref><pubmed>25953818</pubmed></ref>, single cell THS-seq (transposome hypersensitive-site) <ref><pubmed>29227469</pubmed></ref>や [[DNAメチル化]]領域を観察するsnmC-seq、RRBSのような方法も利用されている<ref name=Lake2018><pubmed>28798132</pubmed></ref><ref><pubmed>30237449</pubmed></ref><ref><pubmed> 20852635</pubmed></ref>。 | ||
===データ処理の流れ=== | ===データ処理の流れ=== | ||
====総論==== | ====総論==== | ||