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「超解像蛍光顕微鏡」の版間の差分
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====STED==== | ====STED==== | ||
===Localization Microscopy=== | ===Localization Microscopy=== | ||
[[Image:PALM図8.png|400px|thumb|'''図１ PALMの原理'''<br>'''①光刺激による疎らなPSFPのオン''' | [[Image:PALM図8.png|400px|thumb|'''図１ PALMの原理'''<br>'''①光刺激による疎らなPSFPのオン''' 実際には画像は撮影されないが蛍光状態がオフからオンに切り替わったPSFPの視野内での位置を灰色の点で示した。<br> | ||
'''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得''' | '''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得''' 蛍光観察は主に全反射顕微鏡によって行う。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従った広がりを持つ。撮影後は視野内にあるオンのPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。<br> | ||
'''③座標推定による分子の局在画像の構築''' | '''③座標推定による分子の局在画像の構築''' ②の蛍光一分子画像を2次元のガウス関数で解析する事で、視野内での蛍光分子の「座標」を推定する。同時に推定座標の「不確かさ」も求まる<ref group="注">解析は輝点を2次元のガウス関数<br> | ||
'''④1-Nサイクルの積分によるPALM画像の構築''' 上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで（Nサイクル）繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事でPALM画像が得られる<ref group="注">実際は全ての点をPALM画像に入れるのではなく、推定座標の「不確かさ」が大きな点はPALM画像には含めないという"足切り"操作が行われる。</ref> | ''PSF''(''x'',''y'',''A'',''w<sub>m</sub>'') = ''A'' exp{-[(''x''-''x<sub>m</sub>'')<sup>2</sup> + (''y''-''y<sub>m</sub>'')<sup>2</sup>]/2''w<sub>m</sub>''<sup>2</sup>}<br> | ||
にフィッティングする事で行う。<br> | |||
解析で得られる(''x<sub>m</sub>'',''y<sub>m</sub>'')が推定された分子の座標、''w<sub>m</sub>''は輝点の広がり具合に相当し、以下の式から推定した座標の「不確かさ(σ<sub>''x,y''</sub>)''<sub>m</sub>''」を計算する際に用いられる。他のパラメータとして、蛍光一分子の発した総フォトン数(''N<sub>m</sub>'')・画像の1ピクセルのサイズ(''a'')・バックグラウンドの総フォトン数(''b<sub>m</sub>'')を用いる。<br> | |||
(σ<sub>''x,y''</sub><sup>2</sup>)''<sub>m</sub>'' = (''w<sub>m</sub>''<sup>2</sup> + ''a''<sup>2</sup>/12)/''N<sub>m</sub>'' + 4π<sup>1/2</sup>''w<sub>m</sub>''<sup>3</sup>''b<sub>m</sub>''<sup>2</sup>/''aN<sub>m</sub>''<sup>2</sup> <br> | |||
</ref>。座標推定から構築した点は②の元の点に比べて小さくなるが、極小の一点として表されるわけではなく、この点もまた2次元のガウス関数の輝度分布として表わされる。この2次元のガウス関数の中心は解析により推定された「座標」、標準偏差が「不確かさ」になる。また各一分子の輝度の合計が等しくなるように規格化される。この結果、精度が高く推定された点は小さな明るい点として、精度が低く推定された点は大きな暗い点として局在画像上で表わされる。<br> | |||
'''④1-Nサイクルの積分によるPALM画像の構築''' 上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで（Nサイクル）繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事でPALM画像が得られる<ref group="注">実際は全ての点をPALM画像に入れるのではなく、推定座標の「不確かさ」が大きな点はPALM画像には含めないという"足切り"操作が行われる。</ref>。最終的に得られるPALM画像の輝度は「蛍光分子がその位置で見つかる可能性」に比例するので、PALM画像は分子の出現確率密度地図に相当する。]] | |||
光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では250 nm程度である。しかしながら隣り合った2点が重ならないほど離れていれば、蛍光一分子のPSFを2次元のガウス関数で解析する事で最大1 nm程度の精度で位置を決定できる。この蛍光一分子の正確な位置解析は（FIONA；fluorescence imaging with one-nanometer accuracy）として知られる<ref><pubmed> 12791999 </pubmed></ref>。超解像顕微鏡法の一つであるLocalization microscopy（蛍光一分子局在化顕微鏡法）は、FIONAを利用し光学顕微鏡の分解能を超えた画像を取得する方法である。このようなアイディアは古くから提案されていたが<ref><pubmed> 19859146 </pubmed></ref>、理想的なサンプルを作成するのが困難なため実現はされなかった。例えばGFPを何らかの興味のあるタンパク質と融合させ、それを発現した細胞を想定する。この細胞にFIONAを適用しようとすると、ほぼ確実に以下の問題が生じる。<br> | 光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では250 nm程度である。しかしながら隣り合った2点が重ならないほど離れていれば、蛍光一分子のPSFを2次元のガウス関数で解析する事で最大1 nm程度の精度で位置を決定できる。この蛍光一分子の正確な位置解析は（FIONA；fluorescence imaging with one-nanometer accuracy）として知られる<ref><pubmed> 12791999 </pubmed></ref>。超解像顕微鏡法の一つであるLocalization microscopy（蛍光一分子局在化顕微鏡法）は、FIONAを利用し光学顕微鏡の分解能を超えた画像を取得する方法である。このようなアイディアは古くから提案されていたが<ref><pubmed> 19859146 </pubmed></ref>、理想的なサンプルを作成するのが困難なため実現はされなかった。例えばGFPを何らかの興味のあるタンパク質と融合させ、それを発現した細胞を想定する。この細胞にFIONAを適用しようとすると、ほぼ確実に以下の問題が生じる。<br> | ||
# 発現しているGFPの数が多いため、隣り合ったGFPのPSFが重なりあってしまいFIONAを適用できない。 | |||
# 上記の状況を回避するためにPSFの重なりが無い程度に一つの細胞にGFPを極少なく発現させる事は困難である。 | |||
# 上記が仮に達成できたとしても数個のGFPの詳細位置がわかるだけであり、分子の局在情報としては不十分である。 | |||
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蛍光一分子局在化顕微鏡法はある種の蛍光色素が特定条件下で蛍光状態(オン・オフ)や蛍光色が切り替わる性質を巧みに利用し、これらの問題を回避する事で成立している。それぞれについて以下の項目で紹介する。 | |||
====<small>PALM,FPALM</small>==== | ====<small>PALM,FPALM</small>==== | ||
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====<small>STORM</small>==== | ====<small>STORM</small>==== | ||
STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）もPALM・FPALMとほぼ同時期に発表された<ref><pubmed> 16896339 </pubmed></ref>。STORMではある種の蛍光色素が特定の条件下で可逆的に暗状態(蛍光状態=オフ)へと遷移する現象を利用している。詳細には、シアニン系色素(例：Cy5)に強い励起光(赤色)を与えた際に、一定の確率で寿命の非常に長い暗状態に入る<ref group="注"> | STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）もPALM・FPALMとほぼ同時期に発表された<ref><pubmed> 16896339 </pubmed></ref>。STORMではある種の蛍光色素が特定の条件下で可逆的に暗状態(蛍光状態=オフ)へと遷移する現象を利用している。詳細には、シアニン系色素(例：Cy5)に強い励起光(赤色)を与えた際に、一定の確率で寿命の非常に長い暗状態に入る<ref group="注">この暗状態は寿命が1時間程度とされる。三重項状態の消光剤として働く酸素分子は暗状態の寿命を短くするため、暗状態へは三重項状態から遷移すると考えられる。観察時に必要に応じて培地に酸素除去剤を加える必要があるのはこのためである。また、この暗状態はチオールとの結合により起こるため、還元剤を培地へ添加する場合もある</ref><ref><pubmed> 15783528 </pubmed></ref><ref><pubmed> 19961226 </pubmed></ref>。暗状態において、より蛍光波長の短い別のシアニン系色素(例：Cy3)が近接している際にCy3への励起光(緑色)を与えるとCy5が基底状態(蛍光状態=オン)へ回復する<ref><pubmed> 15783528 </pubmed></ref>。オンになったCy5は強い励起光(赤色)を与えられ蛍光観察に利用される。蛍光観察中にある確率で暗状態(オフ)へと遷移する。Cy5が基底状態へ回復する確率はCy3に与える励起光(緑色)の強度と照射時間とおよそ比例関係にあるので、PALMと同様に励起光(緑色)を適切にコントロールする事で常に視野内のCy5を疎らにオンに保つ事ができる。<br> | ||
====<small>dSTORM,GSDIM</small>==== | ====<small>dSTORM,GSDIM</small>==== | ||