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→FRETの画像検出
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細 (→FRETの画像検出) |
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ドナー蛍光強度は、FRET効率Eと次のような関係に有る。 | ドナー蛍光強度は、FRET効率Eと次のような関係に有る。 | ||
: <math> E = 1 - {F\,'_{\rm D}}/{F_{\rm D}} \!</math> | : <math> E = 1 - {F\,'_{\rm D}}/{F_{\rm D}} \!</math> | ||
ただし、F'<sub>D</sub>、F<sub>D</sub>はそれぞれ、アクセプターがある場合と無い場合でのドナー蛍光強度である。つまり、FRET効率が良い程、F'<sub>D</sub> | |||
ただし、F'<sub>D</sub>、F<sub>D</sub>はそれぞれ、アクセプターがある場合と無い場合でのドナー蛍光強度である。つまり、FRET効率が良い程、F'<sub>D</sub>小さくなる、つまり画像が暗くなる。一方で、FRETによりアクセプター画像は明るくなるので、ドナー画像とアクセプター画像の比を計算する事で、FRETを検出する。 | |||
データを取得、解釈する際に注意しなければいけないポイントがある。 | データを取得、解釈する際に注意しなければいけないポイントがある。 | ||
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蛍光体が励起されると、図2に示すような減衰曲線に従って蛍光を発する。蛍光寿命は、蛍光の減衰曲線の速度定数<math>k \ </math>と逆数の関係にある。 N<sub>0</sub>は励起光によって励起された電子の数、kは励起状態にある電子が基底状態に戻る速度定数であり、蛍光として基底状態に戻る際の速度定数、熱を発して基底状態に戻るなどの無放射遷移の速度定数の和として表される。 | 蛍光体が励起されると、図2に示すような減衰曲線に従って蛍光を発する。蛍光寿命は、蛍光の減衰曲線の速度定数<math>k \ </math>と逆数の関係にある。 N<sub>0</sub>は励起光によって励起された電子の数、kは励起状態にある電子が基底状態に戻る速度定数であり、蛍光として基底状態に戻る際の速度定数、熱を発して基底状態に戻るなどの無放射遷移の速度定数の和として表される。 | ||
FRETを起こしている時のの速度定数k<sub>f</sub>は、以下の式で規定される。 | |||
:<math>k_f(r,\kappa) = \frac{k_DQ_D\kappa^2}{r^6}\left(\frac{9000In10}{128\pi^5n^4N_A}\right)J</math> | :<math>k_f(r,\kappa) = \frac{k_DQ_D\kappa^2}{r^6}\left(\frac{9000In10}{128\pi^5n^4N_A}\right)J</math> | ||
ここで、k<sub>D</sub>はドナーの蛍光の速度定数、Q<sub>D</sub>はドナーの蛍光の量子収率、κはドナーとアクセプターの双極子モーメントの配向、rはドナーとアクセプターの距離、N<sub>A</sub> | |||
ここで、k<sub>D</sub>はドナーの蛍光の速度定数、Q<sub>D</sub>はドナーの蛍光の量子収率、κはドナーとアクセプターの双極子モーメントの配向、rはドナーとアクセプターの距離、N<sub>A</sub>はアボガドロ数、nは溶媒の屈折率である。 | |||
: <math> E = 1 - {\tau'_{\rm D}}/{\tau_{\rm D}} \!</math> | : <math> E = 1 - {\tau'_{\rm D}}/{\tau_{\rm D}} \!</math> | ||
蛍光寿命は、GFPは2.5nsec、YFPでは2.9nsec、mCherryでは1. | ここでτ'<sub>D</sub>とτ<sub>D</sub>はそれぞれ、アクセプターが存在する場合と存在しない場合でのドナー蛍光寿命である。つまり、FRETが起きると、蛍光寿命が減少する(図4)。 | ||
蛍光寿命は、GFPは2.5nsec、YFPでは2.9nsec、mCherryでは1.5nsec程度の値を取る。蛍光寿命プローブとしてはドナーとしてmGFP、アクセプターとしてmRFPもしくはmCherryが用いられる。アクセプターの蛍光は必要ないため、FRETのアクセプターとなるが蛍光を発しないREACh, darkVenus, superREAChなども用いられる。同じ理由により、蛍光寿命は、蛍光強度比測定法に比べて、蛍光の漏れ込み、アクセプターとの局在の違いなどによって生じる疑似陽性を回避できる。 | |||
蛍光寿命の変化を測定する方法は２つある。 | |||
====時間ドメイン==== | ====時間ドメイン==== | ||
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[[Image:FRET-図4.jpg|thumb|right|300px|<b>図4:海馬スライスCA1錐体細胞に発現させたGFPのFLIMイメージおよび減衰曲線</b><br>（横軸は時間、縦軸は光子数）をBecker＆Hickl社software、SPC imageにて取得した。実際には、20秒で数千個オーダーの光子を取得する。これらの光子の発生確率分布が減衰曲線を形成し、近似曲線をフィッティングさせることで蛍光寿命を取得する。]] | [[Image:FRET-図4.jpg|thumb|right|300px|<b>図4:海馬スライスCA1錐体細胞に発現させたGFPのFLIMイメージおよび減衰曲線</b><br>（横軸は時間、縦軸は光子数）をBecker＆Hickl社software、SPC imageにて取得した。実際には、20秒で数千個オーダーの光子を取得する。これらの光子の発生確率分布が減衰曲線を形成し、近似曲線をフィッティングさせることで蛍光寿命を取得する。]] | ||
=== | ====周波数ドメイン==== | ||
光源の強度を高周波で変調させるのと同時に、検出器も高周波で変調させる。その時に光源と検出器の周波数をずらしておく（heterodyning)。多数のサイクルを繰り返す事により、間接的に蛍光寿命を計算していく。画像の取得にかかる時間がtime domainと比較して短いのが特徴である。 | 光源の強度を高周波で変調させるのと同時に、検出器も高周波で変調させる。その時に光源と検出器の周波数をずらしておく（heterodyning)。多数のサイクルを繰り返す事により、間接的に蛍光寿命を計算していく。画像の取得にかかる時間がtime domainと比較して短いのが特徴である。 | ||
時間ドメインと同様に光源にはパルスレーザーや光量が高頻度にて変調できるレーザーなどが用いられる。 | |||
=== | ===異方性測定=== | ||
一つの蛍光団のストークスシフトが小さい場合、励起スペクトルと蛍光スペクトルの重なりが大きいような蛍光団では、同一の蛍光団同士で、[[wikipedia:Homo-FRET|Homo-FRET]]が生じる。Homo-FRETは、蛍光強度および蛍光寿命は変化しないが、異方性が変わる。この原理を用いて、一般的には、分子同士のクラスターの度合いなどに応用されている。 | |||
== プローブのデザイン == | == プローブのデザイン == | ||