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「超解像蛍光顕微鏡」の版間の差分
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===Localization Microscopy=== | ===Localization Microscopy=== | ||
[[Image:PALM図8.png|400px|thumb|'''図１ PALMの原理'''<br>''' | [[Image:PALM図8.png|400px|thumb|'''図１ PALMの原理'''<br>'''①光刺激による疎らなPSFPのオンへのスイッチング''' オンのPSFPの位置を灰色の◯で示した。<br> | ||
'''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得''' | '''②蛍光観察による蛍光一分子画像の取得''' 蛍光観察はPALMでは主に全反射顕微鏡によって行う。得られる輝点は前述のとおり2次元のPSFに従った広がりを持つ。撮影後はいちど視野内にあるオンのPSFPを全て退色させる（あるいは退色するまで撮影を続ける）。<br> | ||
'''③座標推定による分子の局在画像の構築''' ②の蛍光一分子画像を2次元のガウス関数で解析する事で、視野内での蛍光分子の「座標」を推定する<ref group="注">フィッティング式、必要なら最後でOK</ref>。また推定座標の「不確かさ」も同時に求められる。座標推定から構築した点は②の元の点に比べて小さくなるが、極小の一点として表されるわけではなく、この点もまた2次元のガウス関数の輝度分布として表わされる。この2次元のガウス関数の中心は解析により推定された「座標」、標準偏差が「不確かさ」になる<ref group="注">2次元のガウス関数、必要なら最後に</ref>。また各一分子の輝度の合計が等しくなるように規格化される。この結果、精度が高く推定された点は小さな明るい点として、精度が低く推定された点は大きな暗い点として局在画像上で表わされる。<br> | '''③座標推定による分子の局在画像の構築''' ②の蛍光一分子画像を2次元のガウス関数で解析する事で、視野内での蛍光分子の「座標」を推定する<ref group="注">フィッティング式、必要なら最後でOK</ref>。また推定座標の「不確かさ」も同時に求められる。座標推定から構築した点は②の元の点に比べて小さくなるが、極小の一点として表されるわけではなく、この点もまた2次元のガウス関数の輝度分布として表わされる。この2次元のガウス関数の中心は解析により推定された「座標」、標準偏差が「不確かさ」になる<ref group="注">2次元のガウス関数、必要なら最後に</ref>。また各一分子の輝度の合計が等しくなるように規格化される。この結果、精度が高く推定された点は小さな明るい点として、精度が低く推定された点は大きな暗い点として局在画像上で表わされる。<br> | ||
'''④1-Nサイクルの積分によるPALM画像の構築''' 上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで（Nサイクル）繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事でPALM画像が得られる<ref group="注">実際は全ての点をPALM画像に入れるのではなく、推定座標の「不確かさ」が大きな点はPALM画像には含めないという"足切り"操作が行われる。</ref>。最終的に得られたPALM画像の輝度は「蛍光分子がその位置で見つかる可能性」に比例する。]] | '''④1-Nサイクルの積分によるPALM画像の構築''' 上記①～③操作を全てのPSFPがなくなるまで（Nサイクル）繰り返した後に、③で得られた画像を全て足し合わせる事でPALM画像が得られる<ref group="注">実際は全ての点をPALM画像に入れるのではなく、推定座標の「不確かさ」が大きな点はPALM画像には含めないという"足切り"操作が行われる。</ref>。最終的に得られたPALM画像の輝度は「蛍光分子がその位置で見つかる可能性」に比例する。]] | ||
光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では200-300 | 光学顕微鏡の空間分解能は先述のとおり2つの点光源を異なる点として区別する「2点分解能」で表現され、可視光では200-300 nm程度である。しかしながら隣り合った2点が重ならないほど離れていれば、蛍光一分子のPSFを2次元のガウス関数で解析する事で最大1 nm程度の精度で位置を決定できる。この蛍光一分子の正確な位置解析は（FIONA；fluorescence imaging with one-nanometer accuracy）として知られる<ref><pubmed> 12791999 </pubmed></ref>。超解像顕微鏡法の一つであるLocalization microscopy（蛍光一分子局在化顕微鏡法）は、FIONAを利用し光学顕微鏡の分解能を超えた画像を取得する方法である。このような考えに基づいて超解像を達成するというアイディアは古くからあったが<ref><pubmed> 19859146 </pubmed></ref>、理想的なサンプルを準備するのが困難なため実現はされなかった。例えば単純にGFP融合タンパク質を発現した細胞にFIONAを適用するのは、多くの場合で以下の問題が生じる。<br> | ||
１）通常の条件では、発現しているGFPの数が多いため隣り合ったGFPのPSFが重なりあってしまいFIONAを適用できない。<br> | |||
２）この状況を回避するためにPSFの重なりが無い程度に一つの細胞にGFPを極少なく発現させる事は困難である。<br> | |||
３）仮に２）が達成できたとしても数個のGFPの詳細位置がわかるだけであり、分子の局在情報として不十分である。<br> | |||
以下に紹介するそれぞれの蛍光一分子局在化法では、蛍光色素の蛍光状態（蛍光能）や蛍光色が切り替わる性質を利用してこれらの問題を巧妙に回避した。 | 以下に紹介するそれぞれの蛍光一分子局在化法では、蛍光色素の蛍光状態（蛍光能）や蛍光色が切り替わる性質を利用してこれらの問題を巧妙に回避した。 | ||
====<small>PALM,FPALM</small>==== | ====<small>PALM,FPALM</small>==== | ||
蛍光一分子局在化法の一つとしてまず初めにPALM(photoactivated localization microscopy)<ref><pubmed> 16902090 </pubmed></ref> | 蛍光一分子局在化法の一つとしてまず初めにPALM(photoactivated localization microscopy)<ref><pubmed> 16902090 </pubmed></ref>の原理について説明する。PALMは蛍光色素として特定波長の刺激光照射により蛍光状態がオフからオンへ変化するPA-GFPのような「光スイッチング蛍光タンパク質(Photo-Switchable Fluorescent Protein; PSFP)」を利用する。オフからオンへ切り替わる確率は刺激光の強度と照射時間とおよそ比例関係にあるので、それらを適切にコントロールすることで、視野内でPSFが重ならない程度に疎らにPSFPをオンにする事ができる(図-①)。この状態であればFIONAを適用し蛍光一分子の位置解析を行う事ができる(図-②,③)。視野内のPSFPを退色させた後に同じ事をPSFPが全てなくなるまで何度も繰り返す。こうして発現させた全ての蛍光分子の局在画像（PALM画像）を得る事ができる。図では比較のために②で得られた画像の総和も示した。これはPA-GFPを全てオンにして撮った通常の蛍光画像に相当する。通常の蛍光画像では観られなかった「P A L M」の4文字がPALM画像では確認できる。<br> | ||
PALMと同時期に発表されたFPALM（Fluorescence photoactivation localization microscopy）もPALMと同じくPSFPを利用する方法である<ref><pubmed> 16980368 </pubmed></ref>。PALM・FPALMではPA-GFPの他のPSFPとして刺激光により蛍光色が変化するmEOS2(緑色から赤色)が利用される。またケージド蛍光色素の利用も可能である。<br> | |||
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蛍光一分子局在化法はPALM・FPALMの他にも様々な方法が開発されているが、大きく異なるのは図- | 蛍光一分子局在化法はPALM・FPALMの他にも様々な方法が開発されているが、大きく異なるのは図-①においてどのようにして疎らな蛍光分子のオンを達成するかであり、FIONAに相当する図-②,③の操作はどの方法もほぼ同様である。そこでその他の方法については蛍光分子の蛍光状態のオン・オフの切り替えに焦点を絞り、以下で簡潔に説明する。<br> | ||
====<small>STORM</small>==== | ====<small>STORM</small>==== | ||
STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）もPALM・FPALMとほぼ同時期に発表された<ref><pubmed> 16896339 </pubmed></ref> | STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）もPALM・FPALMとほぼ同時期に発表された<ref><pubmed> 16896339 </pubmed></ref>。STORMではある種の蛍光色素が特定の条件下で可逆的に暗状態(蛍光状態=オフ)へと遷移する現象を利用している。詳細には、シアニン系色素(例：Cy5)に強い励起光(赤色)を与えた際に、一定の確率で寿命の非常に長い暗状態に入る<ref group="注">この暗状態は寿命が1時間程度とされる。三重項励起状態の消光剤として働く酸素分子は暗状態の寿命を短くするため、暗状態へは三重項励起状態から遷移すると考えられる。観察時に必要に応じて培地に酸素除去剤を加える必要があるのはこのためである。また、この暗状態はチオールとの結合により起こるため、還元剤を培地へ添加する場合もある</ref><ref><pubmed> 15783528 </pubmed></ref><ref><pubmed> 19961226 </pubmed></ref>。暗状態において、より蛍光波長の短い別のシアニン系色素(例：Cy3)が近接している際にCy3への励起光(緑色)を与えるとCy5が基底状態(蛍光状態=オン)へ回復する<ref><pubmed> 15783528 </pubmed></ref>。オンになったCy5は強い励起光(赤色)を与えられ蛍光観察に利用される。蛍光観察中にある確率で暗状態(オフ)へと遷移する。Cy5が基底状態へ回復する確率はCy3に与える励起光(緑色)の強度と照射時間とおよそ比例関係にあるので、PALMと同様に励起光(緑色)を適切にコントロールする事で常に視野内の疎らなCy5をオンに保つ事ができる。<br> | ||
====<small>dSTORM,GSDIM</small>==== | ====<small>dSTORM,GSDIM</small>==== | ||
STORMでは超解像画像を得るために2つの蛍光色素を必要とするため、マルチカラー化は容易ではなかった。その後に報告されたdSTORM (direct STORM)<ref><pubmed> 18646237 </pubmed></ref>やGSDIM(ground-state depletion | |||
and single-molecule return)<ref><pubmed> 18794861 </pubmed></ref> | and single-molecule return)<ref><pubmed> 18794861 </pubmed></ref>ではこの問題が解決された。これらの方法では、蛍光色素の暗状態からの回復が別の蛍光色素の近接や励起光無しでもある確率で（稀に）起こる事を利用する。そのためCy3とその励起光(緑色)無しに疎らなCy5がオンになる。こうして1つの蛍光色素で超解像画像が得られるようになりマルチカラー化が容易となった。<br> | ||
====<small> | ====<small>その他の方法</small>==== | ||
蛍光一分子局在化法のための蛍光色素の開発は現在も活発にされている。大きな進歩として自然に明滅を繰り返す蛍光色素HMSiR（Hydroxymethyl Si-rhodamine）が開発された<ref><pubmed> 25054937 </pubmed></ref>。これは従来の方法と比べて、暗状態を作るための高濃度のチオールや強い励起光照射が不要なためサンプルへのダメージを抑えられる。また強い励起光照射が必要ではないので全反射顕微鏡でなく共焦点顕微鏡の使用も容易となり、細胞の深部構造の観察が可能となった。<br> | 蛍光一分子局在化法のための蛍光色素の開発は現在も活発にされている。大きな進歩として自然に明滅を繰り返す蛍光色素HMSiR（Hydroxymethyl Si-rhodamine）が開発された<ref><pubmed> 25054937 </pubmed></ref>。これは従来の方法と比べて、暗状態を作るための高濃度のチオールや強い励起光照射が不要なためサンプルへのダメージを抑えられる。また強い励起光照射が必要ではないので全反射顕微鏡でなく共焦点顕微鏡の使用も容易となり、細胞の深部構造の観察が可能となった。<br> | ||