「シングルセルRNAシーケンシング」の版間の差分

シングルセルRNAシーケンシング(single cell RNA sequencing, 以下scRNA-seq)は、次世代シーケンシング （next generation sequencing、以下NGS）技術を使用して個々の細胞が発現しているmRNA全体、つまりトランスクリプトームを質的、量的に網羅的に調べ、細胞ごとの違いを高解像度で検出、分類することで、細胞の分類を行うことができる分子生物学的、コンピュータ生物学的技術である。また、刺激、発生など細胞の状況に応じて、個々の細胞のトランスクリプトームの情報を得ることで、病態や細胞系譜などの解析も可能である。特に多様なニューロンが存在する神経系では、この方法により、神経細胞や非神経細胞の分類や状態についての知見が深まり、更に新しいバイオマーカー(biomarker)の発見などが系統的かつ網羅的に行われるようになった}}

===scRNA-seqの背景と開始===

それ以来、完全長cDNAを増幅したり、細胞ごとに異なる分子識別子（unique molecular identifiers: UMI）を持つcDNAを増幅させるscRNA-seqが考案され始め、2013年には、このような１細胞のシーケンシング技術が、Nature Methods誌のMethod of the Year に選ばれた<ref> https://www.nature.com/collections/mysbdwgfll<ref>。たとえば、SMART-seq（Switch mechanism at the 5' End of RNA Templates）<ref><pubmed>22820318</pubmed></ref>およびその改良されたプロトコルであるSMART-seq2 <ref><pubmed> 24056875 </pubmed></ref> <ref><pubmed>24385147</pubmed></ref>は、完全長cDNA合成のためのプロトコルである（既に、SMART-seq3という改良プロトコールもあるhttps://doi.org/10.1101/817924）。また、MARS-seq（Massively parallel single-cell RNA-seq）<ref><pubmed> 24531970 </pubmed></ref>、STRT（single-cell tagged reverse transcription）<ref><pubmed>21543516</pubmed></ref> <ref><pubmed>24363023</pubmed></ref>、CEL-seq（Cell Expression by Linear amplification and Sequencing）<ref><pubmed>22939981</pubmed></ref>、CEL-seq2<ref><pubmed> 27121950 </pubmed></ref>、Seq-Well <ref><pubmed> 28192419</pubmed></ref>、Microwell-seq<ref><pubmed>29474909</pubmed></ref>などが報告されてきた。最近になって、sci-RNA-seq (single-cell combinatorial indexing RNA sequencing) <ref><pubmed> 28818938 </pubmed></ref>, SPLiT-seq(split-pool ligation-based transcriptome sequencing)<ref><pubmed>29545511</pubmed></ref>のように特殊な機器を利用せずに細胞特異的UMIを保持するcDNAを作製する方法も報告されている。

 

しかしながら、もっとも重要なscRNA-seqの方法論についての進歩は、2015年、Harvard Medical Schoolの独立した２つのグループが、inDropそしてDrop-seqという類似した2つの高スループットな方法を開発したことであろう<ref><pubmed>26000487</pubmed></ref> <ref><pubmed>26000488 </pubmed></ref>。これらの方法では、マイクロ流体力学 (Microfluidics) 、 Cell BarcodeとUMIとしてDNAバーコーディング (DNA barcoding) 、そしてNGSを利用することで、自動化とサンプル調製の容易さから、1つの細胞あたりに要するコストを大幅に低下させることに成功した（Drop-seqは発表時で、１細胞あたり約5セント）。つまり、細胞1つずつをマイクロ流体力学によるエマルジョン技術を利用した装置に流入させ、その１細胞を1つのDroplet（油中水滴）に自動的に閉じ込める。そのDroplet中には、DropletごとにCell barcode/UMIとして異なったDNAバーコードを持つゲルビーズ(Gel Beads in Emulsion, GEMs)が入っており、それを足場に3’末端のみを標的にしたcDNA合成反応を実施することで、同じ細胞に含まれていたmRNAが同じUMIを持つcDNAとして合成され、そのmRNA/cDNAが由来した細胞を識別できるということを利用している（図１）。このようにして3’末端のみを増幅したバーコード付きｃDNAをNGSで配列決定することによりscRNA-seqが可能になる。なお、DropSeqはコストが低いが、細胞の取得率と検出感度が低い弱点がある。inDropはDropSeqより細胞取得率が高く、パラメータを調整することで低レベルで発現される遺伝子の検出にも有利である<ref><pubmed>30472192</pubmed></ref>。

ここでは主流になっている10xGenomics社のChromiumを用いた方法とSMART-seq2などを用いた方法に共通する方法の実際について俯瞰する。scRNA-seqの利用には、4つのステップがある（図２）<ref><pubmed>30089861</pubmed></ref>。１）個体や組織を採集し、そこから細胞あるいは細胞核を個別にすること。２）ChromiumやSMART-seq2などによる個々の細胞からのライブラリーの作製とNGSシーケンシング。３）前処理（preprocessing、得られた配列の整理）。４）ダウンストリーム解析（生物学的な情報を得る）。これらのうち、２）の段階については、上に記述したように市販の機器や試薬を利用する機会が多くなっているので、そのためのマニュアル等を参考にするのが現実的である。

血液細胞のように浮遊した細胞ではない場合、物理的あるいは酵素処理などによって解離することで、生組織から状態の良いバラバラになった細胞を調製する必要がある。神経系組織の酵素処理には、パパインを用いる方法が広く用いられている。ここで、しばしば問題となるのが、酵素処理のため短時間加温することで、発現量が変化する遺伝子が存在することである<ref><pubmed>27090946</pubmed></ref>。例えば、脳のミクログリアの解析には、低温下で組織をホモゲナイズするなどの工夫が必要であった<ref><pubmed>30471926</pubmed></ref>。また、このような現象を抑制するために、酵素処理時に転写阻害剤であるアクチノマイシンで処理したり<ref><pubmed>29024657</pubmed></ref>、ヒマラヤ氷河から得られた細菌Bacillus licheniformisから得られた低温プロテアーゼを用いる方法も報告されている<ref><pubmed>28851704</pubmed></ref>。また、細胞解離後に、メタノールで固定しscRNA-seqに使用することも可能である<ref><pubmed>28526029</pubmed></ref>。

 

 

なお、ヒト組織や希少生物などから生細胞を得ることは困難なことが多い。この場合、scRNA-seqの変法として、凍結した組織から、各細胞由来の核を調製し、核内のmRNAを分析するsnRNA-seq (single-nucleus RNA-seq)が利用されている。ただ、この場合、FACSなどによる特定細胞集団の同定が難しく、細胞質を持つ生細胞を利用した場合と同等な結果が必ずしも得られない<ref><pubmed>24248345</pubmed></ref><ref><pubmed>26890679</pubmed></ref>  <ref><pubmed>27471252</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><<ref><pubmed>29220646</pubmed></ref><ref><pubmed>28846088</pubmed></ref><ref><pubmed>30586455</pubmed></ref><ref><pubmed>28729663</pubmed></ref><ref><pubmed>31728515</pubmed></ref> [https://www.biorxiv.org/content/10.1101/630087v1] 。snRNA-seqでは、組織をそのまま凍結することから開始するので、上述したscRNA-seqの問題である酵素処理や加温などを避けることができる。こうしたプロトコールの一部は、protocols.ioのHuman Cell Atlasのグループ[https://www.protocols.io/groups/hca]で公開されている。

10x Genomics社のChromium、IlluminaのNGSを利用した場合、Cell Ranger(Linux上で作動)を用いて、各生物種ごとのレファレンス配列リスト（[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc]）やEggNOG ([http://eggnogdb.embl.de])などを利用し、細胞とトランスクリプトーム（各遺伝子の発現）の対応マトリックスを作製する。その後のデータの処理についても、10xGenomics社がソフトウェアLoupeを提供している。しかしながら、その後のダウンストリーム解析を考慮して、R言語, Python, MATLABなどのデータ解析のための汎用プログラミング言語やコードで扱えるオブジェクトに変換するのが通常である。ここでは、scRNA-seqデータ解析のために最もよく利用されているR言語を用いたパッケージ「Seurat」<ref><pubmed> 29608179 </pubmed></ref> <ref><pubmed> 31178118 </pubmed></ref>を中心に紹介したい。なお、Pythonを利用したものでは、ドイツ・ミュンヘンInstitute of Computational Biologyの Fabian J. Theisらが開発しているScanpyが有名である<ref><pubmed> 29409532</pubmed></ref>。

 

最初に行うのは、scRNA-seqデータの品質管理である。ここでは、質の低い細胞のデータ（転写産物の種類が少ない、ミトコンドリア由来の転写産物が多い）を取り除く。また、複数の試料を組み合わせる場合には、バッチごとの違いについて検討する。特にDropletを使用するscRNA-seqの多くのケースで問題になるのが、Dropletに２つ以上の細胞が封じ込められ、それらが同じCell barcodeを持つために生じるアーティファクトである。通常Doubletsと呼ばれるこの問題はダウンストリーム解析を混乱させるので、細胞単離の段階から注意する必要があるが、明確なマーカー遺伝子が知られていればscRNA-seqデータ取得後にある程度のデータ処理で検討することは可能である。また、この問題を解決する新たなアプローチも試みられている<ref><pubmed>30954476</pubmed></ref> <ref><pubmed>31836005</pubmed></ref><ref><pubmed>31856883</pubmed></ref> [https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879304][https://doi.org/10.1101/699637]。

このようなノーマライゼーションの過程を経て、scRNA-seqのデータ解析において、最初に行うのが、次元圧縮 (dimensionality reduction)である<ref><pubmed>30617341</pubmed></ref><ref><pubmed>31780648</pubmed></ref>

。PCA (Principal component analysis, 主成分分析)、UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection, 均一マニフォールド近似と投影）、Diffusion maps,  t-SNE(t-distributed Stochastic Neighbor Embedding , t分布型確率的近傍埋込み)などの手法が用いられる。 特に、t-SNE[http://www.jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html]（ティースニーと読むのが通常)は、高次元データを低次元の点の集合として可視化することで、それぞれの細胞の持つトランスクリプトームの類似度についての直観的な表示が可能でありしばしば用いられる（図３）。次に、Louvainアルゴリズムなどでクラスタリング（コミュニティ分割）を行い、tSNEグラフ上に表示できる。こうして、違ったタイプの細胞の集合が別のクラスターとして表示される。しかし、データによっては、tSNEだけでなく、他の方法でパラメータの調節を行うことで違ったデータ解釈（別の細胞クラスターの同定）ができるケースもあり、いくつかの方法を試してみることが推奨される。

scRNA-seqデータから得られる生物学的知見には、内在的に存在する細胞の種類、外部刺激や環境で変化した細胞の状態、そして種類や変化により特徴的に発現するマーカー遺伝子候補の発見がある<ref><pubmed>27824854</pubmed></ref><ref><pubmed>32033589</pubmed></ref>

。クラスタリングにより、異なった細胞集団の存在が認識されると、それぞれのクラスターに特徴的に発現している遺伝子を具体的に探索し、細胞集団の持つバイオマーカーによって、そのクラスターの同定が可能になる。例えば、既にニューロンとグリア細胞に特異的に発現する典型的マーカーはよく知られており、それぞれのクラスターの識別は容易である。更に、ニューロンのタイプごとに区別されるマーカーや神経活動により変化したニューロンの状態は、In situ hybridizationや免疫組織化学などにより確認できる。このようなクラスターごとに発現が異なる遺伝子（差次的発現遺伝子）を見つけるためには（Differential expression analysis, DE analysis）、SeuratのFindMarkersコマンドでも利用可能である目的別の解析のための専用コード（MAST <ref><pubmed>26653891</pubmed></ref>、DESeq2 <ref><pubmed>25516281</pubmed></ref>

など）を用いることができる。scRNA-seqの解析に必要なコードは、scRNA-tools [https://www.scrna-tools.org], Awesome single cell [https://github.com/seandavi/awesome-single-cell], Bioconductor[https://www.bioconductor.org]で紹介されており、ほとんどがダウンロード可能である。また、最新の情報については、bioRxivなどのプレプリントサーバで公開されていることが多く、scRNA-seqのデータ（下記参考）とともに、オープンサイエンス実践の好例となっている。細胞ごとの差次的発現遺伝子の可視化には、ドットプロット、ヴァイオリンプロット、次元圧縮の可視化図に重ねる布置プロットなどが頻繁に用いられる（図４）。

===偽時系列解析、遺伝子制御ネットワーク、パスウェイ解析===

==scRNA-seqの神経科学研究への適用==

===神経細胞多様性の新たな根拠===

様々な神経・精神疾患について理解しその診断や治療に役立てるためには、神経細胞、グリア細胞を中心にした神経系にある細胞の「タイプ」を識別し、それぞれの細胞における分子的な変化を観察することが重要である <ref><pubmed>28775344</pubmed></ref><ref><pubmed>29738987</pubmed></ref>。近年、中枢神経系のグリア細胞にも、多様なアストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリアの存在が報告されてきている。一方で、神経細胞は著しく多様であり、この多様性が神経系を特徴づけており、その多彩で複雑な機能の発現に必須であることは疑う余地がない。解剖学的な視点から言えば、すべての神経細胞の存在する位置は異なるので、すべての神経細胞は異なるという見方もできる。しかし、従来の神経科学では、神経細胞の多様性は、それぞれの神経細胞の解剖学的な位置、発現している分子、電気生理学、結合性、形態、神経伝達物質、神経伝達物質受容体とシグナル伝達によって識別されてきている。こうした神経細胞の多様性を便宜的に記述するのに、タイプ（type）、クラス（class）、サブクラス（subclass）、サブタイプ（subtype） というような用語が用いられてきた。しかし、本稿では混乱を防ぐため、Masland（2004）<ref><pubmed>15242626</pubmed></ref>が提唱し、広く受けいれられている「クラス」と「タイプ」という単語を用いることとする。タイプは、これ以上分類することができないとされる階層である。例えば、大脳皮質の錐体細胞、網膜神経節細胞といった大雑把な識別は「クラス」と呼ぶ。大脳皮質の錐体細胞というクラスは、層や領野によって「タイプ」が異なるし、網膜神経節細胞には視覚情報によって応答が異なる「タイプ」が存在する。この分類は、免疫組織化学、形態、電気生理学などの技術により識別可能である暫定的なものに過ぎない。本項目で解説してきたscRNA-seqの技術は、その網羅性からそれぞれの神経細胞についてこれまでにないビッグデータを提供することで、この神経細胞のタイプの理解に新たな根拠を与えつつある。

 

 

 

 

上衣細胞<ref><pubmed>29727663</pubmed></ref>は、神経幹細胞としての役割が示唆されてきたが、scRNA-seqの結果ではその可能性が支持されていない。グリア細胞では、ラジアルグリア<ref><pubmed>29217575</pubmed></ref><ref><pubmed>26406371</pubmed></ref><ref><pubmed>29539641</pubmed></ref><ref><pubmed>25734491</pubmed></ref><ref><pubmed>29281841</pubmed></ref>  、アストロサイト<ref><pubmed>32139688</pubmed></ref><ref><pubmed>32203496</pubmed></ref>に多様性があることが示唆されてきている。また、オリゴデンドロサイト<ref><pubmed>27284195</pubmed></ref>については、これまで細胞生物学的に研究されてきた分化の過程がscRNA-seqにより検出されている。

 

==scRNA-seqの展望==

===神経系の多様性と進化===

scRNA-seqのデータは様々な目的で利用できるため、データベース化し利用できるようにする必要がある。オープンサイエンスの典型として、神経系のトランスクリプトーム一般のデータベースが多数公開されており<ref><pubmed>29437890</pubmed></ref>、基本的にNCBIのGene Expression Omnibus[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/]に登録されている。また、common coordinate framework (CCF) やcentral annotation platform (CAP)という概念のもと、scRNA-seqを意識したものとして、米国のBRAIN Initiative Cell Census Consortium<ref><pubmed>29096072</pubmed></ref> 、Human Cell Atlas ProjectのHuman Cell Atlas Data Portal [https://data.humancellatlas.org]、アレン脳研究所のAllen Brain Atlas [https://portal.brain-map.org]、ブロード研究所のSingle Cell Portal, 

 

 

===マルチモーダルなシングルセルオミクス===