「液-液相分離」の版間の差分

英: Liquid-liquid phase separation

液-液相分離は液体が2つの相に分かれる現象のことをいう。最近では細胞内にあるタンパク質の集合物が液-液相分離によって形成された液滴（ドロプレット）であるという発見が相次いでおり、生命科学と溶液化学の境界領域に新たな研究分野が広がっている。

液-液相分離と生命現象

液-液相分離（Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS）とは、単一の均質な液体が、特定の条件下で二つの異なる液相に分かれ、それらが共存する現象を指す。LLPSによって成分の濃度が異なる二つの相が形成されるが、それぞれの相の成分は内部でよく混ざり、液体の性質を示すことが特徴である。LLPSは材料科学や化学工業の分野で研究されてきた現象であったが、2015年頃から生命科学において研究が盛んになっている<ref name=Molliex2015><pubmed>26406374</pubmed></ref><ref name=Nott2015><pubmed>25747659</pubmed></ref><ref name=Brangwynne2013><pubmed>24368804</pubmed></ref>[1-3]。

細胞内の構造は、主に脂質二重層によって形成されるオルガネラ（ミトコンドリア、リソソーム、ゴルジ体など）であると考えられていた。しかし、細胞質や細胞核内には膜を持たない細胞内構造（Membrane-less Organelles, MLOs）が多数存在するという見方が広がり、それらの形成メカニズムの解明が求められていた。その契機となったのは、2009年のAnthony Hymanの研究チームのClifford Brangwynneらによる論文であった<ref name=Brangwynne2009><pubmed>19460965</pubmed></ref>[4]。彼らは線虫の生殖細胞に存在するP顆粒が流動性を持った液体であることを報告した。P顆粒がLLPSによって形成されることを指摘し、LLPSが物質の動的な区画化の仕組みとして重要な役割を担っていることが示唆された。

2011年にはBrangwynneらが、核小体がLLPSによって形成されることを報告し、多くの生体分子凝集体がLLPSの原理によって制御されていることが示唆された<ref name=Brangwynne2011><pubmed>21368180</pubmed></ref>[5]。2012年には、米国テキサス大学サウスウェスタン・メディカルセンターに所属するMichael Rosenらの研究チームによるネイチャー誌への論文や<ref name=Li2012><pubmed>22398450</pubmed></ref>[6]、Steven McKnightらの研究チームによるセル誌への論文が<ref name=Kato2012><pubmed>22579281</pubmed></ref>[7]、タンパク質の液滴に関する報告しており、これらの報告をきかっけにLLPSが細胞内の機能の基本原理として認識されるようになった。

生命科学の分野では、ストレス顆粒や生殖顆粒、核小体などのMLOsがLLPSによるものであるとされている<ref name=Brangwynne2013 /> [3]。しかし、このような名前が付けられている明確な細胞内構造物だけでなく、一時的に形成されるもっと小さなLLPSによる集合物も存在するとされ、細胞内でのタンパク質の動的な振る舞いを統合するメカニズムとして注目されている[8]。また、異常なLLPSがタンパク質凝集を引き起こし、筋萎縮性側索硬化症やパーキンソン病などの神経変性疾患の原因となる可能性が示唆されている<ref name=Shin2017><pubmed>28935776</pubmed></ref>[9]。

原理

異なる親水性を持った２種類の高分子（例えば、ポリエチレングリコールとデキストラン）の溶液を混合したときにもLLPSが生じる。高分子の溶液を混合したときに生じるLLPSは、水性二相系（Aqueous Two-Phase System）ということもある<ref name=Iqbal2016><pubmed>27807400</pubmed></ref>[10]。メカニズムは水と油のLLPSと類似しており、ポリエチレングリコールやデキストランは水にはよく溶けるが、互いにはなじまないために相分離する。ATPとポリリン酸のように、細胞内にありふれた分子の水溶液を混合したときにもLLPSが生じる<ref name=Nobeyama2023><pubmed>37967197</pubmed></ref>[11]。

液-液相分離と相図

ATPとポリリン酸の相図の概略を図2Bに示す<ref name=Nobeyama2023 /> [11]。カチオンが存在するときのATPとポリリン酸の相図は島のような形になり、島の内側はATPとポリリン酸が高濃度含まれた液滴が観察されるが、島の外側は相分離しない領域になる。相図を見ると明らかなように、ポリリン酸をある一定の濃度に固定したとき、ATPの濃度を増加させていくとある濃度以上でLLPSが生じて液滴が観察されるが、さらにATPを加えていくと意外にもふたたび単一相になる。ATPとポリリン酸のように、互いに親和性のある成分が相互作用してLLPSが生じる現象を会合的（Associative）相分離という。

リゾチームとオボアルブミンの相図の概略を図2Cに示す<ref name=Nobeyama2024 /> [12]。この相図はATPとポリリン酸の相図に似ており、リゾチームとオボアルブミンは親和性があるためにLLPSが生じる。LLPSが生じたときの濃厚相には、図１にみられるように液滴のような形状になることが多い。また、低濃度のリゾチームと高濃度のオボアルブミンの領域では、液滴ではなく不定形の凝集体が観察される。タンパク質の凝集体の形成はふつう不可逆であり、イオンを加えたり温度を上げたりしても溶けないことが多い。

相分離は他にもさまざまな種類がある。ブロックコポリマーなどの高分子で見られる、ナノメートルからマイクロメートルスケールのサイズで生じる相分離をミクロ相分離という<ref name=Leibler1980>Leibler, L. (1980).<br>Theory of microphase separation in block copolymers. Macromolecules, 13(6), 1602-1617.</ref>

[13]。ミクロ相分離は通常のマクロ相分離とは異なり、完全に相分離せず、特定のナノ構造を形成するのが特徴である。相分離が進むときに粘弾性効果によってネットワーク状構造など異常な形態が形成されることがある。このような相分離を粘弾性（Viscoelastic）相分離という<ref name=Tanaka2000>Tanaka, H. (2000).<br>Viscoelastic phase separation. Journal of Physics: Condensed Matter, 12(15), R207.</ref>[14]。相分離の進行によって状態が変わるケースとして、例えば、一部の成分が結晶化し、それによって相分離が進行する結晶化誘起相分離や、小さな分子やコロイド粒子が除去されることで、残りの成分が相分離する枯渇相分離、化学反応が進行するにつれて組成が変化し、ある時点で相分離が起きる反応誘起相分離などもある。

液滴は流動性を持つことが特徴である。観察対象の顆粒状タンパク質集合物が液滴であるかを判別するには、接触時に融合するかどうかを確認するのが簡便である。液滴の中には、1秒もあれば完全に融合してしまうほど柔らかいものも存在する<ref name=Sakakibara2023><pubmed>37291907</pubmed></ref>[15]。一方で、接触しても融合しない場合、その集合物は液滴ではなく凝集体であると判断できる。

液滴の流動性を定量する方法として、光褪色後蛍光回復法（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）が広く用いられている<ref name=Sprague2005><pubmed>15695095</pubmed></ref>[16]。この手法では、液滴の一部分にレーザーを照射して蛍光を褪色させ、その後の蛍光回復速度から分子の流動性を計測する。細胞内の液滴では、蛍光の回復が秒から分のオーダーの現象として観察されることが多い。ただし、観察対象が液体の性質を持つのか、固体に近い性質を持つのかを蛍光回復の速度論的解析だけで判断するのは難しいとの見解もあり<ref name=McSwiggen2019><pubmed>31594803</pubmed></ref>[17]、慎重な解釈が求められる。

タンパク質のLLPSは、分子間での静電相互作用やπ-π相互作用、カチオン-π相互作用、疎水性相互作用、水素結合など多様な相互作用によって起こる。しかもタンパク質は温度などの溶液条件によって立体構造が変わることも多く、また、他のタンパク質やRNAと特異的に結合することもある。そのため、タンパク質のLLPSは温度やpH、塩濃度、他のタンパク質やRNAなどの存在など、多様な条件に影響を受ける。熱力学的な視点からは、エントロピー的にもエンタルピー的にもLLPSが駆動されるケースがある。複数のタンパク質やRNAからなる液滴は、液滴の中に液滴が形成されるようなケースもある<ref name=Lafontaine2021><pubmed>32873929</pubmed></ref>[18]。

天然変性タンパク質（Natively Unfolded Protein）は、明確な立体構造を持たずに柔軟なコンフォメーションをとるタンパク質のことをいう<ref name=Uversky2002><pubmed>11910019</pubmed></ref>[19]。天然変性タンパク質は本質的に無秩序なタンパク質（Intrinsically Disordered Proteins）ということもある<ref name=Dunker2001><pubmed>11381529</pubmed></ref>[20]。タンパク質の立体構造を形成しない領域は天然変性領域（Intrinsically Disordered Region, IDR）や低複雑性ドメイン（Low Complexity Domain）と呼ばれることがある。IDRはタンパク質のLLPSのために機能する領域である。

天然変性タンパク質は、真核生物の持つタンパク質に多くみられる。30残基以上のIDRを持つタンパク質は、ヒトの場合、30残基以上のIDRを持つタンパク質は約44%と推定されている<ref name=van der Lee2014><pubmed>24773235</pubmed></ref>[21]。一方、天然変性タンパク質は真正細菌やアーキアにはあまり存在しない。

IDRは荷電残基や極性アミノ酸に富んでおり、類似した配列が繰り返し存在するのが特徴である<ref name=Chong2018><pubmed>29913160</pubmed></ref>[22]。例えば、フェニルアラニンとグリシンが繰り返し現れるFGリピートや、アルギニンとグリシンが繰り返し現れるRGGリピートなどのモチーフが知られている。天然変性タンパク質にはRNA結合ドメインを持っているものも多く、RNAと共にLLPSを形成するものがある。

細胞に酸素が不足すると、真核細胞では酸化的リン酸化経路によるATP合成ができなくなる。その結果、META bodyと呼ばれる代謝酵素の集合体が形成されることが2013年に報告されている<ref name=三浦2024>三浦夏子. (2024)<br>出芽酵母で形成される解糖系酵素群の集合体とその制御. 化学と生物 Vol. 62, No. 4</ref> [23]。META bodyは解糖系（glycolysis）に関与する酵素群によって形成されるという意味でグリコリティック体（G-body）と呼ばれることもある。G-bodyにはRNAも含まれており、「膜のないオルガネラ」としての性質を備えている<ref name=Fuller2020><pubmed>32298230</pubmed></ref>[24]。

LLPSは、細胞生理学としての役割だけでなく、異常なタンパク質凝集を引き起こし、筋萎縮性側索硬化症やパーキンソン病、アルツハイマー病、ポリグルタミン病、プリオン病などの神経変性疾患に関与することが示され、医学的な観点からも重要な研究テーマとなっている<ref name=Ahmad2022><pubmed>35998851</pubmed></ref>[25]。特に、TDP-43やFUSなどのタンパク質がLLPSを形成した後、異常な凝集体を形成し、病態につながることが示唆されている<ref name=Patel2015><pubmed>26317470</pubmed></ref>[26]。

シナプスタンパク質によるLLPSは、長期増強現象のメカニズムとして近年注目されている<ref name=Hayashi2021><pubmed>33472825</pubmed></ref><ref name=林2021>林 康紀，細川 智永，劉 品吾，實吉 岳郎. (2021).<br> CaMKII の新しいシナプス可塑性機構. 生化学　第93 巻第2 号，pp. 191-202</ref>[27, 28]。Ca2＋／カルモジュリン依存性キナーゼII（CaMKII）は、記憶の長期増強現象に必須の働きを持つキナーゼである。CaMKIIは神経細胞内に多量に発現しており、シナプス後膜肥厚では全タンパク質の10%から20%を占めるほどになる。このキナーゼがなぜこれほど多量に存在する必要があるのかは、長年の謎として残されていた。林康紀らの研究チームは、CaMKIIがNMDA型グルタミン酸受容体と液滴を形成することで、AMPA型グルタミン酸受容体を活性帯の直下に集合させ、シナプス応答を活性化する新しいメカニズムを提唱している<ref name=Hosokawa2021><pubmed>33927400</pubmed></ref>[29]。

 

 

 

 

 

 

また、IDRを持つタンパク質がLLPSを引き起こしやすいが、IDRを持たない２種類のタンパク質を常識的な溶液条件で混合するだけでもLLPSが起こる。例えば、卵白リゾチームとオボアルブミンのようなありふれたタンパク質を、低イオン強度の条件で中性のpHで混合するだけでもLLPSが生じる<ref name=Iwashita2018><pubmed>30114421</pubmed></ref>[33]。細胞内には飽和濃度に近い高濃度のタンパク質が含まれているため、凝集や相分離が生じやすい環境である<ref name=Vecchi2020><pubmed>31892536</pubmed></ref>[34]。そのため、IDRを持たない代謝酵素なども、細胞内では液滴を形成して機能が制御されているのだと推測できる。

 

実際に試験管の中で液滴を作らせると、活性が2桁も増加する酵素が知られているが<ref name=Ura2023><pubmed>36697449</pubmed></ref>[35]、活性化しない酵素も多い。酵素の活性化や酵素の連続反応がLLPSとどのように関連しているのか、またそれが細胞生理学にどう結びつくのか、これから新しい視点での研究が必要になる。