「2光子顕微鏡」の版間の差分

DOI：<selfdoi />　原稿受付日：2019年12月1日　原稿完成日：201X年X月X日<br>

英語名：two-photon microscope 独：Zwei-Photonen-Mikroskop 仏：microscope à deux photons　中：雙光子顯微鏡

{{box|text=　2光子顕微鏡はレーザー走査型蛍光顕微鏡の一種である。赤外線超短パルスレーザーを顕微鏡の対物レンズを介して標本に入射して焦点付近の蛍光色素のみを励起し、標本から返ってきた蛍光を検出してコンピュータで画像構築する。赤外線を用いるため組織浸透度に優れており、光散乱をもつ厚い組織においてこれまで最大1.6 mm程度までの深さにおける神経細胞の非侵襲観察が報告されている。また、共焦点顕微鏡に近い高い分解能 (~400 nm) での光学観察ができる。これを利用して、厚みのある生体組織や組織スライス標本における高分解能観察に用いられている。このほか、ケージド試薬の局所光分解などの2光子励起の特徴を利用した応用が行われる。}}

[[ファイル:Noguchi Fig1.png|サムネイル|'''図1. 2光子励起について<br>'''1光子励起では、1分子の蛍光色素分子が1個の光子を吸収し、基底状態（s0）からエネルギーの高い励起状態（s1）に励起される。分子内振動で熱エネルギーとして放出する緩和過程を経て励起状態の最も低い準位に至り、その後、数〜数十ナノ秒という時間（蛍光寿命）の後に光子（蛍光）を放出して基底状態に戻る。2光子励起では2つの光子が1つの蛍光分子に同時に吸収されることにより励起状態に至る。2光子励起では、1光子励起に必要な波長の約2倍の波長で励起する。]]

[[ファイル:Noguchi Fig2.png|サムネイル|'''図2. 2光子顕微鏡と共焦点顕微鏡の比較<br>'''2光子顕微鏡では、標本中の焦点付近のみに位置する蛍光色素分子が励起される（赤点）。これに対して共焦点顕微鏡では励起光（青いシェードの部分）が通過する部分の分子が励起される。2光子顕微鏡では焦点付近から放出された蛍光（緑実線）に加えて、蛍光の散乱光の一部（緑点線）も検出して高感度化できる。共焦点顕微鏡では焦点以外からの蛍光はピンホールで遮られるため原理上検出できない。]]

　蛍光分子は光子を吸収して10^-15秒程度で励起状態に遷移し、10^-9~10^-8秒程度の時間（蛍光寿命という）ののちに光子を放出して基底状態に戻る。自然界に一般的に見られる蛍光現象は1つの光子が1つの蛍光分子に吸収される1光子励起によるものである。ところが、特殊な条件下では2個以上の光子が一度に1つの蛍光分子に吸収される多光子励起とよばれる現象が発生する（'''図1'''）。この多光子励起による蛍光を利用して蛍光分子の分布を光学的に観察する顕微鏡を多光子顕微鏡と呼んでいる。現在実装されているレーザーの性能上の制約から2個の光子が一度に吸収される2光子励起が医学・生物学研究によく用いられており、2光子顕微鏡と呼ぶことも多い。本項でも2光子励起を中心に述べる。

* '''組織浸透性が高い'''

共焦点顕微鏡は組織で散乱した蛍光は原理上検出しない。これに対して2光子顕微鏡では、励起する領域を空間的に限局して高解像度を達成するので、散乱される蛍光も含めて検出できればシグナル/ノイズ比を上げることができる。したがって高い開口数かつ視野の広い（しばしば低倍の）対物レンズが2光子励起顕微鏡において検出効率を高くする。もしくは、検出器の位置を標本から見て対物レンズの反対側（トランス側）に置くことも用途によっては可能で、対物レンズよりも開口数と視野の大きい検出用の光学系を配置することもできる。

2光子励起の空間的に限局された領域のみを励起する性質がイメージング以外にも応用されている。例えば、ケージド試薬（関連事項参照）の光分解は1光子励起でも行われるが、励起光が通過する地点は全て分解されるので空間的な制限を加えることが難しい。これに対して2光子励起では1 &micro;m³程度の非常に限局された領域のみで光分解を生じさせることができる。これを利用して、例えば着目する神経細胞のそれぞれの単一シナプスにグルタミン酸やGABAなどの神経伝達物質を投与することが可能となった<ref name=Matsuzaki2011><pubmed>21536760</pubmed></ref><ref name=河西春郎2003>'''河西春郎 (2003).'''<br>新しいケイジドグルタミン酸と２光子励起法を用いた神経機能の解析. ''細胞工学'' 22, 161-164</ref> 。また、photo-activatable [[GFP]](光活性化型GFP)などを用いることによって空間的に限局した領域のタンパク質のみを標識して経過観察することが可能である。逆に単一シナプスの蛍光タンパク質のみを褪色させ、蛍光の回復時間を測定することによって、着目するタンパク質の代謝あるいは拡散速度を求めることも行われる(FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching)。

2光子顕微鏡ではパルスレーザーを用いるために、蛍光寿命(上述)の測定が比較的容易で、これを実現するために追加する装置が市販されている。[[FRET]] ([[Förster共鳴エネルギー移動]])、つまり、蛍光分子同士の近接によるエネルギー移動はドナーの蛍光寿命を短くするので、この蛍光寿命画像顕微鏡法(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy: FLIM)を適用することによって、1種類の蛍光分子の測定で、蛍光分子の濃度によらず高い空間分解能でFRET測定が可能である。