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→シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定
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シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時型放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時型放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool, 放出可能プール、TRP)という。 | シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時型放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）という。[[シナプス小胞]]は開口放出後30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれる(図 3左）。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時型放出プールに再び至る。これをリサイクリングと呼び、これに関係する小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool, 放出可能プール、TRP)という。 | ||
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 10 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプールの全体が染まる。一方、ちょうど RRP にある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 | 細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 10 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプールの全体が染まる。一方、ちょうど RRP にある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて wash out すると RRP が選択的に染まる。この様な解析から、RRP はリサイクリングプールの10-30%でないかと推定されており<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>、TRP が 40程度の小さなシナプスでは RRP の小胞数は4-12個となる。 | ||
次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1- | 次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する。（脱染色 destaining 図3右）。この destaining の時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRP にある小胞の数を[RRP]、その放出確率をPvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均[RRP]*Pvとなる。一方、TRP にある小胞の数を[TRP]、一回の刺激による TRP の蛍光の減弱率を kとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pv = [TRP]*k となり、これからPv=k*[RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとに RRPにある小胞の放出確率を求めることができる <ref><pubmed>23049481 </pubmed></ref>。 | ||
FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。 | FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている<ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。 | ||