FM1-43

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高橋 倫子河西 春郎
東京大学 大学院医学系研究科
DOI:10.14931/bsd.3193 原稿受付日:2013年1月31日 原稿完成日:2013年8月12日
担当編集委員:柚崎 通介(慶應義塾大学 医学部生理学)

FM1-43
Identifiers
149838-22-2
Jmol-3D images Image
PubChem 2733618
Properties
C30H49Br2N3
Molar mass 611.53816
特記なき場合、データは常温(25 °C)・常圧(100 kPa)におけるものである。

 FM 色素は脂質二重膜を可逆的に染める蛍光色素で、シナプス前終末の機能や分泌現象の計測に活用されている。

FM1-43とは

図1. FM 色素による還流と細胞膜の蛍光標識
FM 色素液で細胞を還流すると細胞外膜が蛍光を発する。
 Molecular Probe 社の Fei Mao は William J Betz らとともに、細胞膜を染める一連のスチリル色素を合成した。これらを FM (Fei Mao)色素と呼び、FM1-43 はその代表格である。シナプス前終末の機能解析や、分泌小胞の動態解析に広く用いられる。

 色素の特性として次の3つの性質がある。

  1. 水溶液中に存在する場合に比べ、細胞膜に結合すると量子効率が著増し、強い蛍光を出す。
  2. 脂質二重膜を透過しない。
  3. 両親媒性で可逆的に膜を染める。

分子構造

図2. FM 色素群の分子構造
二重結合の数は色調に、炭素鎖の数は細胞膜との親和性や蛍光強度に関連する。
 構造は、親水性領域、二重結合領域、疎水性炭素鎖領域に分けられる。

 親水性領域が正の電荷をもつため、膜を通過しない。二重結合の数は蛍光波長に関連する。

 二重結合が一つの FM1-43、FM1-84、FM2-10 は黄色蛍光を呈し、二重結合が二つの FM4-64、FM5-95 は赤色蛍光を呈する。

 疎水性炭素鎖の長さは細胞膜の染め方に関連し、長いものほど明るく、一旦膜に組み込まれると離脱しがたい[1]。 FM1-43 の炭素鎖数は 4であり、解離時定数τdissは 8 msを示す。より短いFM2-10(炭素鎖数 2)は、比較的離脱しやすい(τdiss=6.4 ms)。逆に、より長い FM1-84(炭素鎖数 5)は離脱に時間がかかる(τdiss=36 ms)[2]

蛍光特性

 FM1-43の励起には1光子では波長 480 nm光、2光子では波長 840 nm光が頻用される。

 蛍光強度はリポソーム中では 580 nmで最大となる。

 波長 480nm光の高出力励起(~150 μW)にてジアミノベンチジン(DAB)の光変換(photoconversion) を起こす。そのため、アルデヒドで固定可能な色素である FM1-43FXと DABを細胞に与え光変換させると、共局在部位で電子密度の高い産物が作られ、電子顕微鏡観察が可能となる。FM1-43を取り込んだ小胞が、高い電子密度で描出され、微細構造解析に活用されている。

応用例

シナプス前終末における小胞プールの大きさと開口放出確率の測定

図3. 開口放出に伴う FM 蛍光の変化
膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる。
図4. シナプス前終末における小胞プール
即時放出可能プール、再循環プール、静止プールの存在が生理学的な手法や電子顕微鏡による検討などで示唆されている。

 シナプスを刺激した時にミリ秒で起きる伝達物質放出は、活性帯 (active zone)にドックした小胞が開口放出すると仮想されている。この仮想的な小胞群を即時放出可能プール (readily releasable pool, RRP)という。シナプス小胞は開口放出後 30-60秒で細胞内部にエンドサイトーシスで取り込まれる(図 3左)。更に、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時放出可能プールに再び至る。この課程をリサイクリングと呼び、その小胞の集合体が再循環プールRecycling pool)である。即時放出可能プールと再循環プールを総合して、全放出可能プールあるいは全リサイクリングプール (total recycling pool, TRP)という呼称が使われる(図 4)。

 細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激(例 20 Hz、900 発)を与え、開口放出(エクソサイトーシス)した小胞の膜を染め出し、その後色素を含まない溶液で細胞外を還流し、外膜に結合した色素を wash out すると、TRPの全体が染まる。一方、ちょうど RRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激(例 20 Hz、30 発)を与えて wash outをすると RRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPは TRPの 10-30%程度と推定されており[3]、TRPが40個程度の小さなシナプスでは RRPの小胞数は 4-12個となる。

 次に、TRPを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する(脱染色、destaining 図3右)。この脱染色の時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を [RRP]、その放出確率を Pvとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均で Pv [RRP]となる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激による TRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は k [TRP]となる。よって、Pv [RRP] = k [TRP] となり、これからPv = k [RRP]/[TRP] という関係式が得られ、終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる [4]。この Pvと、一回の刺激によりある終末から開口放出が起きる確率 Pr との間には、RRP内の小胞の放出確率が等しければPr=1-(1-Pv)^{{[RRP]}}という関係がある。Prも FM1-43を用いて直接求めた例がある[5]

 FM1-43によって染めることができる TRPの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%にすぎない。[6]。 電子顕微鏡的には同定されるがリサイクリングされ難いシナプス小胞の群を静止プール resting poolあるいは reserve poolと呼ぶ(図 4)。静止プール内の小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって明らかとなっている[7]

シナプス小胞の動態の解析

 開口放出した顆粒はactive zoneの周辺から内部に取り込まれ(エンドサイトーシス)、再び放出可能となる(リサイクル)。このリサイクルにかかる時間は、海馬培養標本では 20-30秒、神経筋接合部では 60秒と見積もられた。TRPを FM1-43で染めた後、DABを光変換して電顕で見ると染色された小胞は、元来小胞があった領域のほぼ全域に拡散し、core(中央部)への拡散のみが軽度に少なかった。また、リサイクルした小胞は、初めて刺激を受けたプール同様の放出確率を持つことが報告された[8]

膜融合様式の解析

 FM色素には、炭素鎖数の異なる複数種類の色素がある。これらが小胞膜を染める頻度を比較することにより、融合細孔の開放時間の長短が識別可能となる。

 FM2-10やFM1-43色素を用い、小胞膜から離脱する完全融合型(full fusion)と、離脱しない不完全融合型(incomplete fusion)の識別が行われた[9] [10]

開口放出現象の可視化

 FM1-43を網膜双極性細胞のシナプス小胞に取り込ませて標識し、全反射顕微鏡で細胞膜直下(~100nm)の観察を行い、単一小胞の開口放出現象の可視化が報告された[11]

 また、下垂体前葉細胞 (lactotrophs) や膵島細胞においても、ホルモンを含む大型有芯小胞膜融合に伴い、開口放出部位においてFM1-43蛍光強度の上昇が報告された [12][13]

分泌小胞の直径測定

 シナプス小胞から大型有芯小胞に至るまで、小胞の直径計測に有効である [14]

 水溶性色素(赤色スルホローダミンB, SRB)と FM1-43を細胞外液に同時に与え、開口放出を誘発すると、水溶性色素は小胞内部に進入し、FM1-43は細胞外膜から小胞内膜へ拡散するため、開口放出した小胞が両色素で描出される。この際 2光子レーザー走査顕微鏡で画像を取得し、双方の色素の増加分の比を求めると小胞直径が計算される(直径=6 ΔSRB/ΔFM1-43)。本法は色素濃度やレンズ特性(点拡がり関数)によらず、シナプス小胞のような光学解像度以下の器官の計測にも応用可能である。

関連項目

参考文献

  1. A J Cochilla, J K Angleson, W J Betz

    Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence.
    Annu. Rev. Neurosci.: 1999, 22();1-10 [PubMed:10202529] [WorldCat.org] [DOI]

  2. Yao Wu, Felix L Yeh, Fei Mao, Edwin R Chapman

    Biophysical characterization of styryl dye-membrane interactions.
    Biophys. J.: 2009, 97(1);101-9 [PubMed:19580748] [WorldCat.org] [DOI]

  3. Silvio O Rizzoli, William J Betz

    The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.
    Science: 2004, 303(5666);2037-9 [PubMed:15044806] [WorldCat.org] [DOI]

  4. Yaroslav S Ermolyuk, Felicity G Alder, Christian Henneberger, Dmitri A Rusakov, Dimitri M Kullmann, Kirill E Volynski

    Independent regulation of Basal neurotransmitter release efficacy by variable Ca²+ influx and bouton size at small central synapses.
    PLoS Biol.: 2012, 10(9);e1001396 [PubMed:23049481] [WorldCat.org] [DOI]

  5. V N Murthy, T J Sejnowski, C F Stevens

    Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses.
    Neuron: 1997, 18(4);599-612 [PubMed:9136769] [WorldCat.org]

  6. Silvio O Rizzoli, William J Betz

    The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.
    Science: 2004, 303(5666);2037-9 [PubMed:15044806] [WorldCat.org] [DOI]

  7. Zhaolin Hua, Sergio Leal-Ortiz, Sarah M Foss, Clarissa L Waites, Craig C Garner, Susan M Voglmaier, Robert H Edwards

    v-SNARE composition distinguishes synaptic vesicle pools.
    Neuron: 2011, 71(3);474-87 [PubMed:21835344] [WorldCat.org] [DOI]

  8. W J Betz, G S Bewick

    Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.
    Science: 1992, 255(5041);200-3 [PubMed:1553547] [WorldCat.org]

  9. J Klingauf, E T Kavalali, R W Tsien

    Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses.
    Nature: 1998, 394(6693);581-5 [PubMed:9707119] [WorldCat.org] [DOI]

  10. David Zenisek, Jürgen A Steyer, Morris E Feldman, Wolfhard Almers

    A membrane marker leaves synaptic vesicles in milliseconds after exocytosis in retinal bipolar cells.
    Neuron: 2002, 35(6);1085-97 [PubMed:12354398] [WorldCat.org]

  11. D Zenisek, J A Steyer, W Almers

    Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.
    Nature: 2000, 406(6798);849-54 [PubMed:10972279] [WorldCat.org] [DOI]

  12. A J Cochilla, J K Angleson, W J Betz

    Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs.
    J. Cell Biol.: 2000, 150(4);839-48 [PubMed:10953007] [WorldCat.org]

  13. Noriko Takahashi, Takuya Kishimoto, Tomomi Nemoto, Takashi Kadowaki, Haruo Kasai

    Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.
    Science: 2002, 297(5585);1349-52 [PubMed:12193788] [WorldCat.org] [DOI]

  14. Haruo Kasai, Hiroyasu Hatakeyama, Takuya Kishimoto, Ting-Ting Liu, Tomomi Nemoto, Noriko Takahashi

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