胚性幹細胞

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塩澤 誠司
慶應義塾大学 医学部
DOI:10.14931/bsd.943 原稿受付日:2012年7月2日 原稿完成日:2015年1月15日
担当編集委員:上口 裕之(独立行政法人理化学研究所 脳科学総合研究センター)

英:embryonic stem cell、英略語:ES cell, ESC 独:embryonale Stammzellen 仏:cellule souche embryonnaire

同義語:ES細胞、胚性多能性幹細胞、EK細胞

 胚性幹細胞(ES 細胞)は、胚盤胞期胚の内部細胞塊(inner cell mass;ICM)から樹立される細胞株であり、生体を構成する全ての細胞に分化し得る多分化能(多能性)と、その多分化能及び正常な核型を維持したまま in vitro において無限増殖できる自己複製能を併せ持つ。

マウス ES 細胞

樹立と培養

図1. マウス ES 細胞
フィーダー細胞層上に島状のコロニーを形成する。(提供:広島大学・神田暁史博士)

 1981 年、Evans と Kaufman によってマウス ES 細胞(原著では EK 細胞と表記)の樹立が初めて報告された[1]。現在までに、より簡便で効率的なマウス ES 細胞の樹立方法が確立されている。典型的には、胚盤胞期まで発生した胚を、フィーダー細胞と呼ばれる増殖阻止したマウス胎児線維芽細胞層上に播種し、分化抑制因子となる白血病抑制因子(LIF)を添加した培地中で ICM を outgrowth させる。十分に増殖した ICM 由来の細胞塊をガラス毛細管で分離し、トリプシン処理により分散させ新たなフィーダー細胞上に播種する。更に培養することで得られる ES 細胞様の形態を示すコロニーを再び分離し、継代培養により増幅することで樹立される。

 マウスにおいてはその遺伝的背景により樹立効率が異なり、現在使用される ES 細胞株はその多くが129系統に由来するものである。近年では、他の近交系からも樹立が報告されているが、一般的に129 系統から得られる ES 細胞よりも安定性は低いとされる。また、樹立効率には性差があり、マウス ES 細胞の多くはオスの胚に由来する。

 マウス ES 細胞はフィーダー細胞上で培養され、一般的には15~20% 程度の牛胎児血清あるいは血清代替物と、LIF を添加した培地で行われる(図1)。近年、ES 細胞の未分化状態維持機構及び分化開始機構の一端が明らかにされるようになり、これに基づき ERK 及び GSK3β を遮断する2つの阻害剤(2i)を培地に加えることで、更に均一で安定な培養を行うことが可能になっている[2]


 未分化状態のマウス ES 細胞は、アルカリフォスファターゼ染色に陽性で、表面抗原である SSEA-1 の発現を認める。また、NANOG, OCT3/4, SOX2 といった転写因子が共発現している。分化抑制因子である LIF を除いた培地中で浮遊培養することで、自発的に分化し、胚様体と呼ばれる三胚葉系の細胞からなる構造体を形成する。また、免疫不全マウスに接種すると、奇形腫(テラトーマ)を形成する。8細胞期胚あるいは胚盤胞期胚に注入することで、個体形成に寄与し、キメラマウスを形成する(後述)。

研究ツールとしてのマウス ES 細胞

 マウス ES 細胞は、初期胚と凝集させ、あるいは注入して子宮に移植することで、その後の個体発生に寄与してキメラマウスを作成することができる。この際、生殖細胞にマウス ES 細胞由来の細胞を持つキメラマウスを得られることがある(Germ line transmission)。このようなキメラマウスを交配し、子孫を得ることで、マウス ES 細胞の遺伝形質を有するマウス個体が得られる。
 このことを利用し、予めマウス ES 細胞に遺伝子改変を施しておくことで、遺伝子改変マウス個体を作出することができる。特に、相同組換え技術を用いてゲノムの特定部位を改変し(標的遺伝子組換え法ジーンターゲティング)、任意の遺伝子を欠失させたノックアウト・マウス作成は、マウス個体における遺伝子機能を解析する際の標準的な手技になった。また、疾患モデルマウスの作出など生命科学分野で多岐にわたり利用され、2007 年にはこの技術に関する功績により Mario R. Capecchi, Sir Martin J. Evans, Oliver Smithies の3氏にノーベル医学・生理学賞が授与された。

 現在では、単純なノックアウト・マウス作成に加え、CreFlp などの部位特異的組換え酵素を応用して、特定の場所及び時期において遺伝子を欠失させる条件付きノックアウト・マウス作成の技術など、遺伝子工学の発達と共に、今なお進展している。

 このような現代の発生工学技術における中心的な貢献と共に、マウス ES 細胞の持つ多分化能は、各種体細胞及び生殖細胞の分化・発生メカニズムを研究するためのツールとしても広く利用されてきた。マウス ES 細胞は LIF を除いた培地中で浮遊培養することで分化し、胚様体と呼ばれる三胚葉系の様々な分化細胞からなる構造体を形成する。この分化は自発的でランダムであるが、培養系を調整することで、目的の細胞系譜へと分化させることも可能である。このような培養系を用いることで、生体内では研究が難しい、初期の胚発生過程における細胞分化を in vitro において再現することができる。この系を用い、細胞の分化過程に関わる遺伝子、必要な成長因子や下流のシグナル伝達などについての詳細な解析が可能になった。

ヒト ES 細胞

樹立と培養

図2.ヒト ES 細胞
平坦な層状のコロニーを形成する。(提供:慶應義塾大学・下門大祐、岡田洋平博士)

 1998 年、ウィスコンシン州立大学の James Thomson らによってヒト胚盤胞期胚からヒトES 細胞株が樹立された[3]。当初、マウス ES 細胞と同様に LIF を添加した培地中で樹立されたが、その後の研究から、ヒト ES 細胞の自己複製に対しては LIF は効果的でなく、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF,FGF2)及びアクチビン A が自己複製を促進することが明らかにされた。また、コロニーの形態もマウスと異なり、平坦な形態を示す(図2)。

 ヒト ES 細胞はマウス ES 細胞と比較して増殖が遅く、不安定で分化しやすい傾向にある。また、トリプシン処理に対して感受性が高く、単一細胞にまで分散させると速やかにアポトーシスが誘導される。そのため、継代の際には穏やかなトリプシン処理条件あるいは物理的処理によってコロニーを数個から十数個の細胞塊として扱う必要があるなど、マウス ES 細胞と比較して扱いが難しい。

主な特徴

 マウス ES 細胞と同様に三胚葉系への分化能を持ち、in vitro において胚様体を形成し、免疫不全マウスへの接種により奇形腫を形成することができる。NANOG, OCT3/4, SOX2 等の転写因子を発現し、アルカリフォスファターゼ染色に陽性を示す点でマウス ES 細胞と類似するが、SSEA1 は発現せず、代わりに SSEA3, SSEA4, TRA1-60 及び TRA1-81 といった表面抗原マーカーの発現を認める。

医療応用への期待

 ヒト ES 細胞株樹立以降、現在に到るまでこのヒト ES 細胞の、医療への応用に焦点を絞った研究が盛んに行われるようになった。ヒト ES 細胞からの in vitro 分化誘導系を応用すれば、特定の細胞を大量に得ることが可能であると考えられ、細胞移植医療において必要な細胞の革新的なソースになると期待された。例えば、神経幹細胞のような、生体からは充分量を採取することができない細胞を誘導し、現在治療法の確立していない脊髄損傷や各種の神経変性疾患に対して、細胞移植によって損傷あるいは変性した組織の修復を図り、治療を行うといった再生医療が可能になる。

 しかしながら、ヒト ES 細胞の元となるヒトの胚盤胞期胚を得ることは容易でなく、またヒト胚に侵襲を加えることに対する社会的な抵抗感があることが問題になった。更に、移植を目指す場合、組織適合抗原の不一致による拒絶反応を防ぐため、患者と同一の組織適合抗原を持ったヒト ES 細胞が必要となるという問題がある。この問題を回避するアイデアとして、核移植技術を用いて患者体細胞からクローン胚を作成し、ES 細胞を樹立することで、患者と同一の遺伝型を持つオーダーメイドの ES 細胞(ntES 細胞)を作成することが検討された。しかし、この方法には大量のヒト未受精卵子が必要である上に、もし子宮に移植すればクローン人間誕生に繋がる可能性がゼロとは言えず、そのようなヒト胚を作成・使用することへの危険性が議論された。更に、ヒト ntES 細胞を作成したとする論文が捏造であったこともこの研究を減速させる大きな要因となった。

 このような背景のなか、体細胞に遺伝子導入することによって ES 細胞に近い性質を持った、人工多能性幹(iPS)細胞を作成する技術が開発され、ES 細胞を使用することによる問題点の多くを解決すると期待されている。しかしながら、iPS 細胞は人工的な操作によって得られる細胞であり、ES 細胞との類似性の厳密な検討が必要であるが、ヒト ES 細胞自体の性質はマウス ES 細胞ほど明らかでなく、ヒト ES 細胞研究と並行して推進することが必須である。また 2013 年には、オレゴン健康科学大学の研究グループにより、上述のヒト ntES 細胞の樹立が報告された[4]。これにより、同一の遺伝的背景を持つヒト iPS 細胞及びヒト ntES 細胞を作成することが可能になり、より厳密な条件下において両者を比較することが可能になった。

マウス ES 細胞とヒト ES 細胞の相違

 マウス ES 細胞及びヒト ES 細胞は共に、着床前の初期胚から得られる細胞株であり、高い分化能と自己増殖能を持つ。しかし、ヒト ES 細胞樹立以降、マウス ES 細胞との性質の違いについても明らかにされてきた。マウス ES 細胞は LIF に応答して自己複製するのに対し、ヒト ES 細胞は LIF には応答せず、bFGF 及びアクチビン A に応答して自己複製するとされる。また、形成されるコロニー形態がマウスでは立体的に盛り上がったドーム状であるが、ヒト ES 細胞においては平坦なコロニーを形成するといった違いがある。このような特徴において、マウス以外の哺乳類から得られる ES 細胞はほとんどがヒト ES 細胞様であり、“マウス型” ES 細胞はラットにおいて特殊な条件下で樹立した ES 細胞のみである。マウス ES 細胞が持つキメラ個体の形成能、Germ line chimera の形成能は、マウス ES 細胞を定義する重要な性質の一つであるが、ヒト ES 細胞に近い性質を持つサル ES 細胞を用いた実験結果から、“ヒト型” ES 細胞ではこの能力は失われているか、著しく低いと考えられている[5]
 このような違いが ES 細胞における種差を反映しているのか、マウス ES 細胞とヒト ES 細胞では異なる発生ステージにある本質的に異なる細胞であるのかは不明である。2007 年にはマウスにおいて着床後の胚から、エピブラスト幹細胞(EpiS 細胞)と呼ばれる新たな胚性多能性幹細胞株が樹立された[6][7]。この細胞は、平坦なコロニーを形成し、bFGF やアクチビン A によって自己複製が促進されるというヒト ES 細胞に類似した性質を有している。また、この細胞ではキメラ形成能がほとんど失われている。これらのことから、ヒトや他の動物における“ES 細胞”は、実際にはマウス EpiS 細胞に相当する細胞であるとする仮説が支持されている。しかしながら、この仮説を直接的に証明する報告は未だ無く、更なる慎重な検証が必要である。現在では、マウス ES 細胞を Naïve state(あるいは Ground state)、ヒト ES 細胞やマウス EpiS 細胞のような細胞を Primed state の胚性多能性幹細胞として便宜上区別されている[8]

 ヒトや他の動物の ES 細胞も、マウスと同様に胚盤胞期胚の ICM から得られるにも関わらず、なぜ Naïve state の ES 細胞が得られないのかはよく分かっていない。マウスと他の動物種では初期の胚発生過程そのものが大きく異なることが近年示唆されており、この違いが影響していると考えられるが、現在のところ不明である。このような疑問を追求することは、学術的意義のみならず、将来ヒト ES/iPS 細胞を医療へ応用する際にも不可欠である。primed state とされるヒト ES/iPS 細胞は、マウス ES/iPS 細胞に比べ、株間あるいはクローン間において分化能など品質の不均一性が大きいという問題がある。初期の胚発生やヒト ES 細胞をより深く知ることで、マウス ES 細胞のような均一で高品質な、医療への応用に適した多能性幹細胞株の樹立に繋がると期待される。

関連項目

参考文献

  1. M J Evans, M H Kaufman

    Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.
    Nature: 1981, 292(5819);154-6 [PubMed:7242681] [WorldCat.org]

  2. Qi-Long Ying, Jason Wray, Jennifer Nichols, Laura Batlle-Morera, Bradley Doble, James Woodgett, Philip Cohen, Austin Smith

    The ground state of embryonic stem cell self-renewal.
    Nature: 2008, 453(7194);519-23 [PubMed:18497825] [WorldCat.org] [DOI]

  3. J A Thomson, J Itskovitz-Eldor, S S Shapiro, M A Waknitz, J J Swiergiel, V S Marshall, J M Jones

    Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.
    Science: 1998, 282(5391);1145-7 [PubMed:9804556] [WorldCat.org]

  4. Masahito Tachibana, Paula Amato, Michelle Sparman, Nuria Marti Gutierrez, Rebecca Tippner-Hedges, Hong Ma, Eunju Kang, Alimujiang Fulati, Hyo-Sang Lee, Hathaitip Sritanaudomchai, Keith Masterson, Janine Larson, Deborah Eaton, Karen Sadler-Fredd, David Battaglia, David Lee, Diana Wu, Jeffrey Jensen, Phillip Patton, Sumita Gokhale, Richard L Stouffer, Don Wolf, Shoukhrat Mitalipov

    Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer.
    Cell: 2013, 153(6);1228-38 [PubMed:23683578] [WorldCat.org] [DOI]

  5. Masahito Tachibana, Michelle Sparman, Cathy Ramsey, Hong Ma, Hyo-Sang Lee, Maria Cecilia T Penedo, Shoukhrat Mitalipov

    Generation of chimeric rhesus monkeys.
    Cell: 2012, 148(1-2);285-95 [PubMed:22225614] [WorldCat.org] [DOI]

  6. Paul J Tesar, Josh G Chenoweth, Frances A Brook, Timothy J Davies, Edward P Evans, David L Mack, Richard L Gardner, Ronald D G McKay

    New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.
    Nature: 2007, 448(7150);196-9 [PubMed:17597760] [WorldCat.org] [DOI]

  7. I Gabrielle M Brons, Lucy E Smithers, Matthew W B Trotter, Peter Rugg-Gunn, Bowen Sun, Susana M Chuva de Sousa Lopes, Sarah K Howlett, Amanda Clarkson, Lars Ahrlund-Richter, Roger A Pedersen, Ludovic Vallier

    Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.
    Nature: 2007, 448(7150);191-5 [PubMed:17597762] [WorldCat.org] [DOI]

  8. Jennifer Nichols, Austin Smith

    Naive and primed pluripotent states.
    Cell Stem Cell: 2009, 4(6);487-92 [PubMed:19497275] [WorldCat.org] [DOI]