「ナノボディ」の版間の差分

==既知ナノボディの例==

　ナノボディの情報を系統的に収集してきている中国の南京にある[[wj:東南大学|東南大学]]の[http://ican.ils.seu.edu.cn iCAN (Institute Collection & Analysis of Nanobody)]<ref><pubmed>29041922</pubmed></ref>には、2018年8月現在、約2400のナノボディ配列が登録されている。

[[ファイル:nanobody2.jpg ‎|サムネイル|200px|'''図2．リャマ由来のGFPナノボディとGFP <br>Protein Data Bank(RCSB)で3OGO<br> http://www.rcsb.org/structure/3OGO]]

[[ファイル:nanobody3.jpg ‎|サムネイル|300px|'''図3．リャマ由来のGFPナノボディのアミノ酸配列 <br>FR1, FR2, FR3, FR4というフレームワーク領域を挟んで超可変領域である相補性決定領域と呼ばれる３つのCDR1, CDR2, CDR3が見られる。リャマ由来のナノボディでは、普通、一本のジスルフィド結合（S-S）がある。]]

しかしながら、通常の免疫グロブリンの可変領域とは異なる特徴が見られ、それがナノボディの長所ともなっている。第１に、通常の免疫グロブリンに比べて、FR2領域に親水性のアミノ酸残基が多く、ナノボディの水溶性の性質や安定性を高めている<ref><pubmed>7831284</pubmed></ref>。第２に、 通常の免疫グロブリンの6つのCDR（重鎖3つ、軽鎖3つ）の代わりに3つのCDRのみで抗原と結合する。その結果、認識に必要な構造（[[パラトープ]]paratope）が凸型で小さいので、通常の免疫グロブリンが入り込めないような隠れた抗原の構造（[[エピトープ]]epitope）を認識できる可能性がある<ref><pubmed>16537393</pubmed></ref>。第３に、通常の抗体より長いCDR1, CDR3ループを持つために、結合の親和性や特異性を高めることが可能となっている。これらの水溶性、構造的なコンパクトさ、そして超可変領域の配列の多様性が、通常の免疫グロブリンの可変領域と違ったナノボディの特性である。

通常、ナノボディは、目的別に発現ベクターにクローニングした後、 哺乳類細胞だけなく、 細菌、酵母、植物でも産生させることができる。哺乳類細胞では、抗体が本来機能する細胞外だけでなく、細胞内部でも発現させることが可能である（イントラボディ、下記参考）。ただし、ナノボディの配列はそれぞれ異なり、ジスルフィド結合の生成が抗原との結合力あるコンフォメーションを取るために必要な場合、細胞外とは還元環境の異なる細胞内や細菌などでは活性のあるものが産生できないものもある。ナノボディの中には90℃という高温でも失活しないものもあるように<ref><pubmed>10209277</pubmed></ref><ref><pubmed>24739391</pubmed></ref>、一般に安定性は高いが、これも各ナノボディのアミノ酸配列から生じる特性による。

==新規ナノボディの作製法==

一般的な方法としては、重鎖抗体を産生する動物を飼育し、それを抗原で免疫することで、重鎖抗体が得られる。 比較的小型のリャマのほかに、アルパカ、ヒトコブラクダ、小型のネコザメ（Heterodontus francisci）などが免疫に利用されている。次に免疫された動物から血液を採集し、その中にあるB細胞から、可変領域を含むcDNAライブラリーをM13ファージを使った[[ファージディスプレイ]]ライブラリーに組み込み、固定化した抗原を使ったスクリーニングすることで、cDNA配列を単離し、抗原に結合するナノボディ配列を知ることができる<ref><pubmed>24577359</pubmed></ref><ref><pubmed>19554288</pubmed></ref>。ラクダ科動物の遺伝子を組み込んだマウスも開発されているが、その利用は一般的ではないようである<ref><pubmed>16148123</pubmed></ref><ref><pubmed>17015837</pubmed></ref>。 

特に、最近、これらの方法を組み合わせることで、効率的に行う戦略が考案されている。Fridyらは、免疫動物の結合抗体を精製しその質量スペクトルの結果とファージディスプレイのハイスループットな配列決定を組み合わせる方法で、蛍光タンパク質に結合する多数のナノボディを報告した<ref><pubmed>25362362</pubmed></ref>  。Zimmermann は、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、ELISAを組み合わせることで、短期間にナノボディ配列を得る戦略を報告している<ref><pubmed>29792401</pubmed></ref>。また、McMahon らは、酵母ディスプレイを用いて、免疫動物を用いない合成ライブラリーをスクリーニングすることで親和性の高いナノボディ配列を得ることができることを示している<ref><pubmed>29434346</pubmed></ref> 。ただ、このような非免疫ライブラリーや合成ライブラリーを用いる方法については、まだ適用例が多くなく、標準的な方法とされるものが存在しないというのが実情であろう。また、ある程度の抗原親和性を示すナノボディの配列を調整することで、[[親和性の成熟]]（affinity maturation）を行うこともできる<ref><pubmed>15777944</pubmed></ref> 。将来的には人工知能などを使ったナノボディのデザインなども可能になるのかもしれない<ref><pubmed>29672675</pubmed></ref><ref><pubmed>28953867</pubmed></ref>。

==ナノボディの利用法==

====化学的カップリング====

免疫組織化学に最もよく用いられているのは、ナノボディをタンパク質として精製後、色素分子などを化学的にカップリングするという方法である。このような試薬は既製のナノボディ試薬として市販もされている（例、ChromoTek社<ref>https://www.chromotek.com/</ref> ）。最近、1次抗体を認識する「2次抗体」の活性を持つナノボディが報告されている<ref><pubmed>29263082</pubmed></ref> 。ナノボディの多くは、大腸菌で活性あるものを大量産生、精製することができるので、一度、配列がわかれば、動物を使用する必要がなくなる。

また、化学的なカップリングなので、カップリングする分子を変化させ工夫することで、目的に合わせて様々な標識ナノボディ（薬剤を結合した武装抗体など）を作製できる可能性がある<ref><pubmed>28883823 </pubmed></ref> 。しかし、カップリングによるアミノ酸残基を修飾する反応により抗原結合能を失うことも想定される。しかし、修飾するアミノ酸残基の位置を制御することは可能である<ref><pubmed>26633879</pubmed></ref> 。ナノボディは小さく、通常の抗体では入り込めない箇所に結合することで、STORMやPALMなどの[[高解像度顕微鏡]]においても、アーチファクトが減少し、有用なツールになると考えられている<ref><pubmed>23845946</pubmed></ref> 。

化学的カップリング反応は、しばしばナノボディの活性を消失させるが、実験的にも条件決定など必ずしも容易ではない。この問題を克服するために開発されたプラットフォームがRANbody（Receptor-and-Nanobody)である<ref name=yamagata2018><pubmed>29440485</pubmed></ref>。RANbodyは、ナノボディを酵素（改良型[[wj:西洋ワサビペルオキシダーゼ]HRP）、抗原性のあるニワトリ抗体IgY、多重エピトープタグなどと組み換えDNA技術により融合させたものである。プラスミドを293T細胞などの動物細胞に導入するだけで、培地中に放出されるので多くの生物医学系の実験室で利用できる。HRPは大腸菌の中では活性のある酵素として発現させることができない。その一つの解決策として、アスコルビン酸オキシダーゼAPEX2との融合タンパク質を大腸菌で発現させて用いることができるが、APEX2はHRPに比べて活性が弱い<ref><pubmed>29915061</pubmed></ref><ref><pubmed>25419960</pubmed></ref> 。

====免疫沈降法====

免疫沈降法（プルダウンPulldown）では、GFPナノボディなどをアガロースや磁気ビーズなどの担体にカップリングすることで得られた担体が市販されているので利用できる。また、多くのナノボディは大量に自家精製できるので、通常の抗体などのアフィニティクロマトグラフィ担体を作製するのと同じように利用可能である。例えば、GSTなどとの融合タンパク質は、GSTを結合するグルタチン結合ゲルに容易に結合するので、免疫沈降法に有用である<ref><pubmed>18936248</pubmed></ref> <ref><pubmed>17951627</pubmed></ref> <ref><pubmed>25964651</pubmed></ref> 。

'''クロモボディ'''Chromobodyは、ナノボディをGFPなどの蛍光タンパク質と結合することで、標的分子に結合し、標的分子の染色や追跡を可能にする方法である。例えば、アクチンに対するナノボディをGFPと融合させ、それを細胞内で発現させれば、アクチンがナノボディを介してGFPで標識される（アクチンーナノボディーGFP）。この融合させる蛍光タンパク質を[[STORM]], PALMなどの[[高解像度顕微鏡]]に利用できる分子種とすれば、高解像度のバイオイメージングも可能である<ref><pubmed>22543348</pubmed></ref><ref><pubmed>17060912</pubmed></ref><ref><pubmed>28883823</pubmed></ref>。 

更に、特殊な構造を認識できるナノボディを利用すれば、分子の変化を追跡することが可能になる。例えば、活性型と非活性型のβ2-adrenoceptorの[[wj:コンフォメーション]] を識別できるナノボディ<ref><pubmed>23515162</pubmed></ref> を使って、同分子の特殊なコンフォメーションを細胞内で観察ができる。また、GFPナノボディのあるものは、GFPを2つに分割した断片と再構成したGFPを区別できる<ref name=yamagata2018/>。リン酸化、アセチル化などの[[wj:翻訳後修飾]]（Post-translational modification, PTM) された抗原を認識するナノボディは、翻訳後修飾のセンサーとして利用される<ref><pubmed>23942372</pubmed></ref>。

ナノボディは、[[分子間相互作用]]（Protein-protein interaction, [[PPI]])の研究ツールとしても有用である<ref><pubmed>24115738</pubmed></ref><ref><pubmed>29949961</pubmed></ref>。このために、１つの効果的な使用法は、イントラボディとして発現させ、[[FRET]]、[[LRET]]といったPPIを検出するための方法と組み合わせたバイオイメージングである<ref><pubmed>28725224</pubmed></ref><ref><pubmed>27510808 </pubmed></ref><ref><pubmed>27249560 </pubmed></ref>。また、細胞外分子のPPI研究のツールとしても利用されている<ref><pubmed>27644106</pubmed></ref><ref><pubmed>30033369</pubmed></ref>。   

また、特定のPPIを阻害するナノボディを細胞内で発現させたりすることも可能である。このような方法は、分子機能の研究において、タンパク質の数を調整する[[RNAi]]や[[ゲノム編集]]による変異法とは違ったアプローチである<ref><pubmed>28913971</pubmed></ref> 。

また、[[ユビキチン系]]を利用することで、ナノボディの標的タンパク質を特異的に分解することも可能である<ref><pubmed>22157958</pubmed></ref>。

免疫グロブリンに由来するナノボディ以外に、免疫グロブリン以外に見られるタンパク質のドメインを用いて、新たな'''組み換え結合体'''を作製する方法もあり、原理的にはこのような組み換え結合体はナノボディと同じ利用法が可能である<ref name=Helma2015><pubmed>26056137</pubmed></ref><ref><pubmed>28249355</pubmed></ref> 。

細胞接着分子[[wj:フィブロネクチン]中の代表的なモチーフであるtype IIIリピートは、免疫グロブリンドメインと構造が類似しており、これを他の分子に結合する免疫グロブリンのように改変することが可能である。この方法は、'''モノボディ'''（monobody）と名付けられている<ref><pubmed>22198408</pubmed></ref>。この方法は、ナノボディと違って、ジスルフィド結合によって構造が左右されないので、 細胞内での還元状態の環境でも利用できる可能性が広がる。例えば、Arnoldのグループによって開発された'''FingR'''は、[[PSD95]]や[[ゲフィリン]]といったシナプスタンパク質を認識することができる<ref><pubmed>23791193</pubmed></ref> 。

免疫グロブリンを利用しない組み換え結合体には、このほかにも、アンキリンリピートを利用した'''DARPin'''（Designed ankyrin repeat proteins)などの方法がある<ref name=Helma2015/>。DARPinは認識に関わる構造が凹型になりやすく、パラトープが凸型でタンパク質中に埋もれた構造を認識しやすいナノボディとは対照的である。一般にナノボディは小分子を認識するものは作製が困難であるとされており<ref name=Arbabi2017/>、ナノボディー以外の組み換え結合体はこのようなナノボディの弱点を克服するのに有用であろう。

近年、生命科学系の研究では、論文発表された実験結果の一部が容易に再現できないとされる問題がしばしば指摘されている。抗体の利用は、この再現性問題の重要な要因の１つであるとされる<ref><pubmed>25993940</pubmed></ref><ref><pubmed>29688318</pubmed></ref>。例えば、ウサギなどからのポリクローン抗体は、多数の異なる抗体分子を含んだポリクローン抗体という性格上、免疫した動物などバッチごとの差が大きい。また、[[wj:モノクローン抗体]]は、ハイブリドーマ細胞を増殖させることで、永遠に同じものを得ることができるはずであるが、市販抗体は予期せず販売中止になったり、ハイブリドーマ細胞は極低温で凍結維持しなくてはならず、災害や個々の研究者の都合により失われてしまうこともある。ナノボディは、アミノ酸配列レベルで定義されるので質は同じであり、DNAという形で安価で長期保存が可能である。万一DNAが失われても、登録されたアミノ酸配列をもとにして容易に再生できるので、抗体の利用研究の再現性問題の解決法として注目されている。

従来の抗体同様に、診断や細胞分離技術への利用とともに、次世代の[[抗体医薬]]として、感染症、がん、自己免疫疾患、移植や再生医療、神経系疾患などへの適用が期待される<ref name=Arbabi2017/><ref name=wang2016><pubmed>27499623</pubmed></ref><ref><pubmed>29163515</pubmed></ref>。 Ablynx社が開発した 後天性血栓性血小板減少性紫斑病を対象とした抗VonWillebrand因子ナノボディであるcaplacizumabは、既に第III相試験で良好な結果が得られている<ref>http://www.ablynx.com/rd-portfolio/overview/</ref>。近年、抗体医薬が世界の医薬品売上高ランキングの上位に位置していることから考えて、その実用の将来性は大きい（参考：平成26年度 特許出願技術動向調査報告書～抗体医薬）<ref>http://www3.keizaireport.com/report.php/RID/245009/</ref>。また、農業分野でもその利用が注目されている<ref name=wang2016/>。