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<br> [[Image:FRET-図1.jpg|thumb|right|300px|<b>図1:蛍光体が蛍光を発する過程を示したヤブロンスキーダイヤグラム。青色で示した励起光によって、蛍光体の電子が励起状態に到達する。励起された電子は、回転および振動エネルギーを失いながら励起状態の最低準位に行き着く。この電子は緑色で示した蛍光を発して励起状態から基底状態に戻る。実際は、最低準位に行き着く前に基底状態に戻ることもあり、これが蛍光波長の幅に反映される。</b>]] [[Image:FRET-図2new.jpg|thumb|right|250px|<b>図2:励起光によって励起された電子が基底状態に戻る際の減衰曲線。緑の太い線がFRETが起きていない時の減衰曲線。FRETの速度定数が加わることにより速度定数が大きくなり細い緑の線のように減衰曲線の傾斜が大きくなる。</b>]] [[Image:FRET-図3.jpg|thumb|right|300px|<b>図3:ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルに重なりがあるときに、FRETが起きる。黒破線で囲まれたスペクトルは、励起スペクトルを示す。緑色のタンパク質がドナー、赤色タンパク質がアクセプターを示す。</b>]] | <br> [[Image:FRET-図1.jpg|thumb|right|300px|<b>図1:蛍光体が蛍光を発する過程を示したヤブロンスキーダイヤグラム。青色で示した励起光によって、蛍光体の電子が励起状態に到達する。励起された電子は、回転および振動エネルギーを失いながら励起状態の最低準位に行き着く。この電子は緑色で示した蛍光を発して励起状態から基底状態に戻る。実際は、最低準位に行き着く前に基底状態に戻ることもあり、これが蛍光波長の幅に反映される。</b>]] [[Image:FRET-図2new.jpg|thumb|right|250px|<b>図2:励起光によって励起された電子が基底状態に戻る際の減衰曲線。緑の太い線がFRETが起きていない時の減衰曲線。FRETの速度定数が加わることにより速度定数が大きくなり細い緑の線のように減衰曲線の傾斜が大きくなる。</b>]] [[Image:FRET-図3.jpg|thumb|right|300px|<b>図3:ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルに重なりがあるときに、FRETが起きる。黒破線で囲まれたスペクトルは、励起スペクトルを示す。緑色のタンパク質がドナー、赤色タンパク質がアクセプターを示す。</b>]] | ||
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=== ドナーとアクセプターの蛍光強度比を測定する方法 === | === ドナーとアクセプターの蛍光強度比を測定する方法 === | ||
ドナーおよびアクセプターの蛍光を取得後、ドナーとアクセプターの蛍光強度比が計算される。FRETが起きると、ドナーの蛍光強度が減少し、アクセプターの蛍光強度が増加する。現在、最も広く使用されている手法である。データを取得、解釈する際に注意しなければいけないポイントがある。 | |||
まず、ドナーの蛍光のアクセプターチャンネルへの漏れ込みであり、SN比の減少の原因となる。改善点としては漏れ込みを極力抑える適切なバンドパスフィルターを用いることである。次に、ドナーおよびアクセプターのバックグラウンドが、FRET変化に影響を与える。サブトラクションすることで、より正しいFRET効率が得られる。次に、2分子間FRETで起きることであるが、ドナーとアクセプターの局在の違いは疑似FRETを生じる。リンカーで連結し1分子にすること、局在しているアクセプターの蛍光強度を計算することで修正することが可能である。現在、多数の遺伝子工学的に作製されたタンパク質FRETプローブにおいて、CFPとYFPのFRETペアが広範に用いられている。近年、CloverとmRuby2が開発され、より良いFRETペアであると報告されている<ref><pubmed>22961245</pubmed></ref>。 | |||
=== アクセプターブリーチング法 === | === アクセプターブリーチング法 === | ||
適切な波長によって、アクセプターを退色させることでFRETを解消することができる。 | |||
この解消度合いより生じていたFRETを算出する。この手法は不可逆的であるために経時的変化を追うことは困難である。 | |||
=== ドナーの蛍光寿命を測定する方法 === | === ドナーの蛍光寿命を測定する方法 === | ||
蛍光体が励起されると、図2に示すような減衰曲線に従って蛍光を発する。蛍光寿命は、蛍光の減衰曲線の速度定数<math>k \ </math>と逆数の関係にある。 蛍光寿命は、GFPは2.5nsec、その色彩変異体,黄色蛍光タンパク質YFPでは2.9nsec、mCherryでは1.5nsecの値を取る。FRETが起きるとドナーの蛍光寿命が減少する(図4)。 | |||
FRETが起きると、蛍光寿命が減少する。蛍光寿命の変化を測定する方法は2つある。time domainおよびfrequency domainである。Time domainについては、近年、データ処理速度の向上により、メガヘルツオーダーのパルス励起光によって励起された一つ一つの光子を、迅速に検出する時間相関単一光子計数法が発展してきた。励起光によって発生した一つ一つの光子が検出器まで届くまでの時間(数nsec)の確率分布が減衰曲線を形成するため、時間を横軸としてヒストグラムを作製することができる。time domainは、フーリエ変換によってfrequency domainに変換可能である。Double exponetial fittingによって、FRETの起きている割合が算出できる。蛍光寿命プローブとして、ドナーとしてmGFP、アクセプターとしてmRFPもしくはmCherryが用いられる。FLIMの場合、アクセプターの蛍光は必要ないため、FRETのアクセプターとなるが、蛍光を発しないREACh, dark Venus, super REAChなども用いられる。蛍光寿命は、蛍光強度比測定法に比べて、蛍光の漏れ込み、アクセプターとの局在の違いなどによって生じる疑似FRETを回避できる。FRETデータ取得において、より理想的であると考えられる。 | |||
[[Image:FRET-図4.jpg|thumb|right|300px|<b>図4:海馬スライスCA1錐体細胞に発現させたGFPのFLIMイメージおよび減衰曲線（横軸は時間、縦軸は光子数）をBecker＆Hickl社software、SPC imageにて取得した。実際には、20秒で数千個オーダーの光子を取得する。これらの光子の発生確率分布が減衰曲線を形成し、近似曲線をフィッティングさせることで蛍光寿命を取得する。</b>]] | |||
=== 異方性を測定する方法 === | === 異方性を測定する方法 === | ||
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この原理は、一分子内にドナーとアクセプターを連結し、これらの配向および距離の変化を利用する。２分子間FRETに生じるような発現量の違いやドナーとアクセプターの局在の変化によって生じるアーチファクトなどを考慮する必要がない。さらに活性に伴うタンパク質の構造変化などを利用するために、比較的容易に応答するプローブが作製できるが、ドナーとアクセプターを適切な位置に配置するなどの検討が必要である。 | この原理は、一分子内にドナーとアクセプターを連結し、これらの配向および距離の変化を利用する。２分子間FRETに生じるような発現量の違いやドナーとアクセプターの局在の変化によって生じるアーチファクトなどを考慮する必要がない。さらに活性に伴うタンパク質の構造変化などを利用するために、比較的容易に応答するプローブが作製できるが、ドナーとアクセプターを適切な位置に配置するなどの検討が必要である。 | ||
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３－１タンパク質の構造変化を基にしたFRETプローブ | ===３－１タンパク質の構造変化を基にしたFRETプローブ=== | ||
興味のあるタンパク質が、活性化の際に構造変化を誘起することが知られている場合には構造変化を利用することができる。タンパク質のC末およびN末にドナーおよびアクセプターを連結する。この手法は、CaMKII<ref><pubmed>15788767</pubmed></ref>、Calcinulin<ref><pubmed>18493642</pubmed></ref>, raf<ref><pubmed>15711535 | 興味のあるタンパク質が、活性化の際に構造変化を誘起することが知られている場合には構造変化を利用することができる。タンパク質のC末およびN末にドナーおよびアクセプターを連結する。この手法は、CaMKII<ref><pubmed>15788767</pubmed></ref>、Calcinulin<ref><pubmed>18493642</pubmed></ref>, raf<ref><pubmed>15711535</pubmed></ref><ref><pubmed>16858395</pubmed></ref>、膜電位測定<ref><pubmed>18622396</pubmed></ref>、などに用いられている。 | ||
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===３－２タンパク質結合に伴う構造変化を基にしたFRETプローブ=== | ===３－２タンパク質結合に伴う構造変化を基にしたFRETプローブ=== | ||
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===３－３共有結合修飾によって生じる構造変化を測定するプローブ=== | ===３－３共有結合修飾によって生じる構造変化を測定するプローブ=== | ||
このプローブは、ドナー、アクセプター、共有結合修飾を受けるドメイン、これを認識するドメインからなる。プローブが共有結合修飾を受けると、認識するドメインが結合し、ドナーとアクセプターの距離が縮まりFRETが起きる。このプローブは、キナーゼの活性化を測定するために使用される<ref><pubmed>11875431 | このプローブは、ドナー、アクセプター、共有結合修飾を受けるドメイン、これを認識するドメインからなる。プローブが共有結合修飾を受けると、認識するドメインが結合し、ドナーとアクセプターの距離が縮まりFRETが起きる。このプローブは、キナーゼの活性化を測定するために使用される<ref><pubmed>11875431</pubmed></ref><ref><pubmed>11752449</pubmed></ref>。 | ||
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===３－４生体膜上の小分子を測定するFRETプローブ=== | ===３－４生体膜上の小分子を測定するFRETプローブ=== | ||
このプローブは、主に、脂質分子に応用されてきた。ドナー、脂質結合ドメイン、アクセプターが堅いヘリックス構造で連結され、グリシングリシン配列をその途中に導入することで、そこを中心に一方の蛍光タンパク質が回転することができる。膜結合ドメインを用いて、プローブを結合させる。脂質分子が増えた際に、脂質結合ドメインが脂質分子を認識し、構造変化が起き、ドナートアクセプターの距離が縮まりFRETが生じる。ジアシルグリセロール<ref><pubmed>16990811</pubmed></ref>, | このプローブは、主に、脂質分子に応用されてきた。ドナー、脂質結合ドメイン、アクセプターが堅いヘリックス構造で連結され、グリシングリシン配列をその途中に導入することで、そこを中心に一方の蛍光タンパク質が回転することができる。膜結合ドメインを用いて、プローブを結合させる。脂質分子が増えた際に、脂質結合ドメインが脂質分子を認識し、構造変化が起き、ドナートアクセプターの距離が縮まりFRETが生じる。ジアシルグリセロール<ref><pubmed>16990811</pubmed></ref>, | ||
イノシトールリン脂質群<ref><pubmed>14528311 | イノシトールリン脂質群<ref><pubmed>14528311</pubmed></ref><ref><pubmed>18685081</pubmed></ref><ref><pubmed>18685081</pubmed></ref><ref><pubmed>18685081</pubmed></ref>を測定するために用いられている。 | ||
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