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[[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] | [[Image:Takahashinoriko fig 3.jpg|thumb|250px|'''図3．（タイトル：開口放出に伴う FM 蛍光の変化''' 説明：膜融合時、細胞外色素の有無により蛍光変化の様式が異なる）]] | ||
シナプスを刺激した時ミリ秒で放出は、ドックした小胞によると仮想されている即時性放出プール[[Readily releasable pool]]（RRP）にある小胞が開口放出すると考えることができる。 開口放出の後に[[シナプス小胞]]は30-60秒で細胞内部に[[エンドサイトーシス]]で取り込まれた後(図 3左）、シナプス終末内でシナプス小胞に再生されて即時性放出プールに再び至る。この様に、リサイクリングしている小胞の全体をリサイクリングプール(recycling pool)という。 | |||
細胞外を FM1-43 で還流中に、長い放出刺激（例 10 Hz、900 発）を与え[[開口放出]]([[エクソサイトーシス]]）した小胞の膜を染めた後、細胞外を色素を含まない溶液で還流し、細胞外膜に結合した色素を wash out すると、リサイクリングプール(放出可能プール、TRP)の全体が染まる。一方、ちょうどRRPにある小胞を枯渇させる程度の短い放出刺激（例 20 Hz、30 発）を与えて負荷後にwash outをするとRRPが選択的に染まる。この様な解析から、RRPはリサイクリングプールの10-30%でないかと推定されている<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 | |||
次に、リサイクリングプールを染めた小胞に刺激を与えると、シナプス小胞は細胞膜と融合し、FM1-43が細胞外液へ拡散することにより神経終末の蛍光は減弱する（destaining 図3右）。このdestainingの時間経過は、小胞の開口放出確率が大きい程速い。定量的には、RRPにある小胞の数を[RRP]、その放出確率をPrとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は平均[RRP]*Prとなる。一方、TRPにある小胞の数を[TRP]、一回の刺激によるTRPの蛍光の減弱率をkとすると、一回の刺激で放出される小胞の数は[TRP]*kとなる。よって、[RRP]*Pr = [TRP]*k となり、これからPr=k*[RRP]/[TRP] という関係式から終末ごとにRRPにある小胞の放出確率を求めることができる。 | |||
FM1-43によって染めることができるリサイクリングプールの小胞は、電子顕微鏡的に終末に存在する小胞の15-20%である<ref><pubmed> 15044806 </pubmed></ref>。 この電子顕微鏡的に同定されるリサイクリングされ難いシナプス小胞の群をreserve pool 或いは resting poolと言う。このプールの小胞もゆっくりとしたリサイクリングに関係していることが他の方法によって指摘されている <ref><pubmed>21835344 </pubmed></ref>。 | |||
==== シナプス小胞の動態の解析 ==== | ==== シナプス小胞の動態の解析 ==== | ||